靶向Survivin siRNA对乳腺癌MCF-7细胞雌激素受体表达的影响*

黄 菁， 虞 玲，隋 俊， 张永臣

南京市第二医院检验科，南京 210003



靶向Survivin siRNA对乳腺癌MCF-7细胞雌激素受体表达的影响*

黄 菁， 虞 玲△，隋 俊， 张永臣

南京市第二医院检验科，南京 210003

目的 探讨靶向Survivin siRNA对乳腺癌MCF-7细胞雌激素受体表达的影响。方法 构建靶向Survivin siRNA载体，按照质粒类型分为空白对照组、阴性对照组和阳性实验组，空白对照组仅加入Lipofectamine 2000，阴性对照组加入空载质粒，阳性实验组加入靶向Survivin siRNA质粒，采用RT-PCR检测Survivin、ER mRNA表达水平，采用Western blot检测细胞Survivin、ER蛋白表达水平，并采用MTT法检测各组对MCF-7细胞增殖抑制率。结果 以β-actin作为内参照，空白对照组Survivin、ER mRNA表达量分别为(1.17±0.14)和(0.79±0.11)，阴性对照组分别为(1.15±0.12)和(0.80±0.09)，阳性实验组分别为(0.43±0.03)和(1.94±0.41)，阳性实验组Survivin mRNA表达显著低于空白对照组、阴性对照组，ER mRNA表达显著高于空白对照组、阴性对照组(均P<0.05)；空白对照组、阴性对照组Survivin、ER mRNA表达量比较差异无统计学意义(均P>0.05)。Western blot结果显示，阳性实验组Survivin蛋白表达显著低于空白对照组和阴性对照组，ER蛋白表达显著高于空白对照组和阴性对照组。细胞增殖实验结果显示，阳性实验组接种12、24、48 h后MCF-7细胞增殖的抑制率逐渐升高，并显著高于同时段空白对照组和阴性对照组(均P<0.05)。结论 通过siRNA技术干扰Survivin表达能够显著提高MCF-7细胞雌激素受体表达水平，靶向Survivin siRNA在ER阳性乳腺癌的基因治疗中具有潜在的临床价值。

雌激素受体； 小干扰RNA； 乳腺癌； 细胞增殖； Survivin

Survivin属于凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族成员之一[1-2]，在调节细胞凋亡和有丝分裂中扮演着重要角色。国外研究[3]证实Survivin高表达与肿瘤细胞凋亡、放化疗敏感性等生物学行为密切相关。Survivin特异性较高，在正常组织中不表达或仅少量表达，而在肿瘤细胞中呈高表达，因此被认为是肿瘤基因治疗的理想靶点[4-5]。小干扰RNA[6](small interfering RNA，siRNA)能够介导双链RNA转录后基因沉默，因其具有高度特异性和靶向性，而成为基因功能研究的主要工具。在本研究中，我们构建了靶向Survivin siRNA真核表达载体，并转染至乳腺癌MCF-7细胞株，观察其对MCF-7细胞雌激素受体(estrogen receptors，ER)的影响，旨在为扩展乳腺癌的治疗思路提供依据，现将研究结果总结如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

乳腺癌细胞株MCF-7购自东南大学医学实验动物中心，Pgenesil-1质粒载体、质粒提取试剂盒购自武汉淼灵生物科技有限公司，Survivin、ER、GAPDH单克隆抗体、BamHⅠ、SacⅠ、EcoRⅠ购自Sigma公司，转染试剂Lipofectamine 2000、Trizol试剂盒购自Invitrogen公司，荧光标记的羊抗兔IgG抗体、β-肌动蛋白(β-actin)抗体、PVDF膜、胰蛋白酶、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、RPMI 1640培养液购自武汉博士德生物工程有限公司，细胞转染试剂METAFECTEN购自德国Biontex公司，培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司，SuperSignal West Pico化学发光底物购自美国PIERCE公司。

1.2 实验方法

1.2.1 MCF-7细胞培养 将购买的MCF-7细胞株置于RPMI 1640(含0.1 g/L链霉素、105U/L青霉素和100 mL/L的小牛血清)培养液中，37℃，5%CO2饱和湿度条件下传代培养。

1.2.2 靶向Survivin siRNA载体构建 Survivin目的基因的序列：5′-GCAGCACCGGATGTGTAGA-3′，按照基因序列设计2条DNA链：5′-GATGCGGAGCAGGCGATGTGTAGATTGAAGAG-GTCTACAGATGGCGTGGTGGTTTTTTGAA-TTCA-3′和5′-GCGTGCTGGCCTACGAATCTAACTTGTGCAGATGTGTACGGGAGCAACAG-GAAAAAACTTAAGT-3′；引物结构：正义链+BamHⅠ+反义链+环状结构+终止信号+SacⅠ，上述设计的2条链磷酸化后与Pgenesil-1质粒载体相连，EcoRⅠ酶切使Pgenesil-1质粒载体线性化，琼脂凝胶将大片段回收。取连接产物并转化为感受态细胞，均匀涂布于含30 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃恒温孵育过夜。用无内毒素的质粒提取试剂盒将质粒载体提取，SacⅠ酶切鉴定、测序，-20℃冰箱保存。

1.2.3 MCF-7细胞转染 取生长旺盛期MCF-7细胞系，接种于24孔培养板中，加入胎牛血清培养，倒置显微镜下观察，待细胞密度为80%～90%时，开始进行转染。分别将1.0 μg质粒、2.5 μL Lipofectamine 2000相互混匀，并用PBS稀释至50 μL，再加入至24孔培养板中进行转染，转染24 h后倒置荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。

1.2.4 Survivin、ER mRNA检测 将细胞接种于培养皿中，分为空白对照组、阴性对照组和阳性实验组，每组为3个培养皿；空白对照组仅加入Lipofectamine 2000，阴性对照组加入空载质粒，阳性实验组加入靶向Survivin siRNA质粒，分别转染MCF-7细胞。转染24 h后加入胰蛋白酶消化，收集106个细胞，按照Trizol试剂盒提取总RNA。采用RT-PCR检测Survivin、ER mRNA表达水平。按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，并逆转录成cDNA。按照预先设计好的引物：Survivin上游引物为5′-GGATCGCTCGGCGCAGCTTG-3′，下游引物为5′-CGTGGGCGGAGAGGGGTGA-A-3′；ER上游引物为5′-GACGTTGGCGGTGTTCAGTCTGCC-3′，下游引物为5′-TGGCTGCGA-CGTACGATTAGAGAC-3′；β-actin上游引物为5′-GTGCATGCTCGGCTGCGTCT-3′，下游引物为5′-GGTCTGAGGTTCAGCGTTGC-3′。Survivin扩增条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，65℃退火45 s，72℃延伸1 min，40个循环后72℃ 5 min；ER扩增条件：95℃预变性5 min，95℃变性15 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，45个循环后72℃ 5 min。记录检测指标的Ct值，每组测量3次，取平均值，以β-actin为内参照，计算Survivin、ER mRNA相对表达量(2-ΔΔCt)。

1.2.5 Survivin、ER蛋白检测 采用Western blot检测细胞Survivin、ER蛋白表达水平。培养板细胞融合度>80%时，将培养液吸出，PBS冲洗3次；再向每孔中加入100 μL含1%PMSF的细胞裂解液，待细胞完全裂解后，15 000 r/min离心5 min，留取上清液。将上清液移至EP管中，加入等量上样液，100℃煮沸5 min，使蛋白完全变性。SDS-PAGE电泳分离蛋白，并转移至PVDF膜上，100 mA、40 min电转后将PVDF膜取出。5%脱脂牛奶封闭2 h，加入Survivin、ER单克隆抗体，4℃孵育过夜；PBS冲洗3次，再分别加入羊抗兔IgG抗体(二抗)，室温下振摇3 h，PBS冲洗3次。荧光图像扫描及条带灰度值分析，Survivin、ER蛋白相对表达量为样本条带与GAPDH条带灰度值之比。

1.2.6 MCF-7细胞增殖抑制率检测 将空白对照组、阴性对照组和阳性实验组细胞接种于96孔培养板中，每组设8孔，每孔150 μL，分别于接种后12、24、48 h采用MTT法检测MCF-7细胞增殖，计算增殖抑制率，增殖抑制率=(1-观察组吸光度值/空白对照组吸光度值)×100%。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 质粒的鉴定

正确的克隆将酶切出1条400 bp的小带，由图1可见，M1、M2在400 bp无印迹，质粒阳性在400 bp的印迹较质粒阴性更明显，由此可知目的克隆正确，且整个条带无明显杂带，证实目的基因未被污染，转染目的基因成功。

M1：Marker 1；M2：Marker 2；①：质粒阴性；②：质粒阳性图1 质粒酶切鉴定凝胶电泳图Fig.1 Gel electrophoresis of the plasmids identification by enzyme digestion

2.2 Survivin siRNA转染MCF-7细胞结果验证

由图2可见，将质粒转染至MCF-7细胞24 h后，在倒置荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达，说明质粒已经成功转染至MCF-7细胞，MCF-7靶向Survivin siRNA模型构建成功。

2.3 三组Survivin、ER mRNA表达水平

以β-actin作为内参照，空白对照组Survivin、ER mRNA表达量分别为(1.17±0.14)和(0.79±0.11)，阴性对照组分别为(1.15±0.12)和(0.80±0.09)，阳性实验组分别为(0.43±0.03)和(1.94±0.41)，阳性实验组Survivin mRNA表达显著低于空白对照组、阴性对照组，ER mRNA表达显著高于空白对照组、阴性对照组(均P<0.05)；空白对照组、阴性对照组Survivin、ER mRNA表达量差异无统计学意义(均P>0.05)，见图3。

图2 Survivin siRNA转染MCF-7细胞24 h后绿色荧光蛋白表达情况(×400)Fig.2 Expression of green fluorescent protein in MCF-7 cells 24 h after transfection with survivin siRNA (×400)

与阳性实验组比较，#P<0.05图3 空白对照组、阴性对照组、阳性实验组Survivin、ER mRNA表达水平Fig.3 mRNA expression levels of survivin and ER in the blank control group，negative control group，and positive experimental group

2.4 三组Survivin、ER蛋白表达水平

阳性实验组Survivin蛋白表达强度显著低于空白对照组和阴性对照组，ER蛋白表达强度显著高于空白对照组和阴性对照组，见图4、5。

2.5 各组对MCF-7细胞增殖抑制率

阳性实验组接种12、24、48 h后MCF-7细胞增殖率逐渐升高，并显著高于同时段空白对照组和阴性对照组(均P<0.05)，见表1。

M：Marker；①：阳性实验组；②：阴性对照组；③：空白对照组图4 各组Survivin蛋白表达水平Fig.4 Protein expression levels of Survivin in each group

M：Marker；①：阳性实验组；②：阴性对照组；③：空白对照组图5 各组ER蛋白表达水平Fig.5 ER protein expression levels in each group

组别12h24h48h空白对照组841±058#834±037#871±068#阴性对照组826±047#868±053#832±038#阳性实验组1827±1482736±4433683±578

与阳性实验组比较，#P<0.05

3 讨论

Survivin基因同时具有调节细胞周期和凋亡的作用，国外研究[7-8]证实Survivin能够抑制Caspases，并能与CDK4/p21结合，阻断细胞凋亡途径，从而发挥凋亡抑制作用。宰红艳等[9]也证实Survivin与Cyclin、CDK等一起参与了细胞周期、细胞分裂等过程，在细胞增殖、分化、凋亡中发挥重要作用。胡梦泽等[10]通过miRNA阻断细胞内Survivin的表达，结果显示细胞微管被破坏，导致多倍体形成，细胞分裂受阻。近年来大量研究[11-13]也证实了Survivin与恶性肿瘤的发生密切相关。Survivin特异性高，在正常组织表达较低，但是在恶性肿瘤组织中呈过表达，且与肿瘤血管的形成、放化疗的敏感性以及远期预后密切相关。抑制了Survivin基因，能够降低肿瘤的恶性表型，诱导肿瘤细胞发生凋亡，因此Survivin是恶性肿瘤诊断、治疗的一个理想靶点。然而Survivin在各种肿瘤中分布并不均衡，有研究显示Survivin在乳腺癌组织中表达最高，在肾癌、结直肠癌中表达最低[14]。李庆霞等[15]也证实雌二醇能促进Survivin表达，并诱导ER阳性乳腺癌细胞增生。Yakirevich等[16]对170例乳腺癌患者采用免疫组化法进行研究，结果显示91.2%患者Survivin蛋白阳性，而在癌旁和正常组织中均表达阴性，该作者认为Survivin基因对乳腺癌的靶向特异性较好。

RNA干扰是生物体普遍存在的一种现象，其通过参与双链RNA所介导的特定序列发生转录后而发生的基因沉默过程。Ambardekar等[17]报道称外源性双链RNA整合到细胞内，会被Dicer酶识别，并切割成短小RNA，即siRNA。siRNA会与RNA沉默复合体结合并特定降解同源mRNA，从而抑制目的基因的表达。钟兴等[18]采用腺病毒构建了Survivin siRNA表达载体，结果显示Survivin siRNA转染效率更高，并能特定抑制乳腺癌细胞的增殖、分裂。本研究参考李莉萍等[19]的报道，设计了靶向Survivin siRNA真核表达载体，由于其载体含有增强绿色荧光蛋白，因此可以通过荧光显微镜更清晰地观察转染效率。本研究结果显示阳性实验组Survivin mRNA表达显著低于空白对照组、阴性对照组，ER mRNA表达显著高于空白对照组、阴性对照组，Western blot检测Survivin、ER蛋白也得到相同结果，说明Survivin基因能够抑制MCF-7细胞Survivin表达和上调ER表达。Sarti等[20]报道称雌二醇能够诱导Survivin表达，而高浓度孕激素又可以下调Survivin表达，提示Survivin与ER之间可能存在相互调节的关系。管海涛等[21]也证实抑制Survivin可以上调ER的表达，并提高乳腺癌细胞的活性，抑制肿瘤细胞的增殖。本研究亦显示阳性实验组接种12、24、48 h后MCF-7细胞增殖抑制率逐渐升高，并显著高于同时段空白对照组和阴性对照组，提示Survivin基因有抑制肿瘤细胞增殖的作用。然而Survivin与ER相互调控机制依然不清楚，推测可能是抑制Survivin的表达会诱导雌二醇与ER结合，并促进MCF-7细胞对雌二醇和ER依赖性，从而加速细胞的凋亡。

综上所述，通过siRNA技术干扰Survivin表达能够显著提高雌激素受体的表达，并增强MCF-7细胞的增殖抑制率，靶向Survivin siRNA在ER阳性乳腺癌的基因治疗中具有潜在的临床价值。

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(2016-05-30 收稿)

Effect of siRNA-targeted Survivin on the Expression of Estrogen Receptor of Breast Cancer MCF-7 Cells

Huang Jing，Yu Ling△，Sui Jun et al

Clinical Laboratory，the Second Hospital of Nanjing City，Nanjing 210003，China

Objective To explore the effect of siRNA-targeted survivin on the estrogen receptor(ER) of breast cancer MCF-7 cells.Methods The siRNA vectors that could target survivin were constructed. Three groups were set up according to different plasmids added: blank control group, in which lipofectamine 2000 was added; negative control group, in which the empty plasmids were given; positive experimental group, in which survivin siRNA was transfected into the cells. mRNA expression levels of survivin and ER were detected by RT-PCR and their protein levels by Western blotting. The inhibition rate of MCF-7 cells proliferation was detected by MTT assay. Results With β-actin as an internal reference, the mRNA expression levels of survivin and ER were(1.17±0.14) and(0.79±0.11) in blank control group,(1.15±0.12) and(0.80±0.09) in negative control group, and(0.43±0.03) and(1.94±0.41) in positive experimental group. The mRNA expression levels of survivin were significantly decreased and those of ER increased in positive experimental group as compared with blank control and negative control groups(P<0.05). There was no significance in the mRNA expression levels of survivin and ER between the blank control group and the negative control group(P>0.05). Similar findings were also observed in the expression of survivin and ER at the protein level. The proliferation inhibition rate was gradually increased from 12, 24 to 48 h in the positive experimental group, which was significantly higher than that in blank control and negative control groups at the same time point(P<0.05).Conclusion Interfering survivin expression by siRNA technology can significantly enhance the ER levels in MCF-7 cells, suggesting survivin siRNA has potential clinical value in the gene therapy of ER-positive breast cancer.

estrogen receptor； small interfering RNA； breast cancer； cell proliferation； survivin

*国家自然科学基金资助项目(No.81101999)

R737.9

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.05.004

黄 菁，女，1974年生，主管技师，E-mail：360354891@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：weijunnanjin@163.com