miR-7对胃癌细胞SGC7901增殖、迁移及侵袭能力的影响及其与黏着斑激酶相关性研究

王建国， 史春云， 王建飞， 曹 丽， 钟 理

1河北大学附属医院检验科，保定 0710002保定市儿童医院小儿内科，保定 0710513河北大学生命科学院，保定 071000



miR-7对胃癌细胞SGC7901增殖、迁移及侵袭能力的影响及其与黏着斑激酶相关性研究

王建国1， 史春云2△， 王建飞3， 曹 丽3， 钟 理3

1河北大学附属医院检验科，保定 0710002保定市儿童医院小儿内科，保定 0710513河北大学生命科学院，保定 071000

目的 探讨miR-7对胃癌细胞SGC7901增殖、迁移及侵袭能力的影响及其与黏着斑激酶(FAK)相关性。方法 培养人胃癌SGC7901细胞，将细胞分为miR-7 mimics组、miR-阴性对照组和空白对照组，分别转染miR-7模拟物(miR-7 mimics)、miR-阴性序列和不做任何处理。Real-time PCR检测miR-7表达，MTT法检测细胞增殖情况，Transwell小室检测细胞迁移能力和细胞侵袭能力，Western blot检测FAK和FAK Tyr397蛋白表达，利用Pearson相关分析对变量间相关关系进行分析。结果 miR-7 mimics组细胞中miR-7相对表达量(2.86±0.47)，显著高于miR-阴性对照组(1.03±0.15)和空白对照组(1.06±0.17)，差异有统计学意义(F=635.985，P<0.01)；miR-7 mimics组24、48、72和96 h细胞生长抑制率均高于miR-阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)；迁移实验中，miR-7 mimics组平均迁移细胞数[(159.52±5.94)/视野]，显著低于miR-阴性对照组[(315.42±7.59/视野]和空白对照组[(307.53±8.16)/视野]，差异有统计学意义(均P<0.05)；侵袭实验中，miR-7 mimics组平均侵袭细胞数[(29.85±4.52)/视野]，显著低于miR-阴性对照组[(85.42±5.59)/视野]和空白对照组[(88.53±6.16)/视野]，差异有统计学意义(均P<0.05)；miR-7 mimics组细胞中FAK、FAK Tyr397蛋白表达量均低于miR-阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)；Pearson相关分析显示，细胞中miR-7表达量与FAK和FAK Tyr397蛋白表达量均呈负相关(r=-0.724和-0.874，均P<0.01)。结论 过表达miR-7可显著抑制胃癌SGC7901细胞增殖、迁移及侵袭过程，可能与负性调控FAK蛋白表达有关。

miR-7； 人胃癌SGC7901细胞； 迁移； 侵袭； 黏着斑激酶

胃癌作为我国高发病率的恶性肿瘤，早期多无特异性临床症状或体征，临床确诊时多已处于中晚期，导致患者预后不佳，具有较高病死率[1]，目前，该病发生机制尚未完全明确。微小RNA(micro RNA，miRNA)作为具有多种生物学功能的高度保守短小非编码RNA，在细胞增殖、分化、凋亡，以及肿瘤发生中发挥重要作用[2]，研究表明，胃癌组织中miRNA表达谱发生改变。miR-7作为miRNA重要类型[3]，在肿瘤组织中发挥抑癌因子作用，与多种恶性肿瘤发生、进展及转移过程有关[4-5]。miR-7在胃癌中存在多种信号通路调控不同的靶基因抑制胃癌的发生及进展[6]。黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)是广泛存在于生物体且无受体的酪氨酸激酶，在调控细胞迁移、粘附、侵袭等生物学行为中发挥重要作用[7]。本研究拟探讨miR-7对胃癌SGC7901细胞株增殖、迁移及侵袭能力的影响，及其与FAK表达和活性的相关性，以期为胃癌发生机制研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌SGC7901细胞株购自中国科学院上海细胞库。RPMI 1640培养液、DMEM培养液、胰蛋白酶、胎牛血清、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Sigma公司，Trizol总RNA提取试剂盒、Lipofectamin 2000转染试剂盒均购自美国Invitrogen公司，miR-7、miR-7模拟物(miR-7 mimics)、miR-阴性对照及内参引物均由上海生工公司设计合成，逆转录试剂盒和PCR试剂盒均购自北京中杉生物公司，Transwell小室购自美国Coming Costar公司，兔抗FAK多克隆抗体和兔抗FAK Tyr397多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，HRP标记二抗购自碧云天生物技术公司。实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，全自动酶标仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养及转染

人胃癌SGC7901细胞于DMEM培养液(含10%胎牛血清)，37℃、5%CO2中传代培养。细胞分为miR-7 mimics组、miR-阴性对照组和空白对照组。取对数生长期细胞，以3×105/孔接种于6孔培养板，培养24 h后，更换培养液，利用Lipofectamin 2000转染试剂盒分别转染miR-7 mimics(5′-UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU-3′)、miR-阴性对照序列(5′-UUCUCCGAACGUGUC-CGGAGAATT-3′)以及空白质粒。各组细胞继续在37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3 Real-time PCR检测miR-7表达

转染48 h后，以胰酶消化，加入细胞裂解液，利用Trizol总RNA提取试剂盒对总RNA进行提取并检测样品纯度，用逆转录试剂盒获得模板链cDNA，以cDNA为模板用PCR试剂盒进行PCR。miR-7和内参引物序列分别为：miR-7上游：5′-GGAAAGGCTCATTCGGACTA-3′，下游：5′-ACGACGCCACCAATCACT-3′；U6上游：5′-TCAG-TTTGCTGTTCTGGGTG-3′，下游：5′-CGGTTGGCTGGAAAGGAG-3′。PCR反应条件：94℃ 60 s，92℃ 45 s，56℃ 30 s，74℃ 30 s，连续进行38个循环。每个样品均设置3个平行反应复孔。用2-ΔΔCt法计算不同转染组细胞中miR-7相对表达量。

1.4 细胞生长抑制实验

取生长期细胞接种于96孔板，分别于24、48、72和96 h，将MTT液加入各孔，继续培养5 h，将培养液除去，加入DMSO，室温下振荡混匀15 min，利用全自动酶标仪测量490 nm波长处各孔吸光度值(A值)，计算生长抑制率=(1-A实验组/A对照组)×100%。每个样品重复进行3次实验。

1.5 细胞迁移能力检测

取转染后48 h细胞，用胰蛋白酶对细胞进行消化后收集细胞，PBS液洗涤3次，加入RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清)重新悬浮，调整细胞密度为1×105/mL，取200 μL细胞悬液加入各孔，将500 μL RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清)加入Transwell小室下室，于37℃、5%CO2条件下恒温培养。将上室中培养液去除，PBS液洗涤3次，95%乙醇固定，PBS洗涤3次，将小室膜取出，经固定、染色后，倒置显微镜观察，随机取5个视野计数穿膜细胞数，取均值。每个样品均设置3个平行反应复孔。

1.6 细胞侵袭能力检测

Matrigel胶于4℃冰箱中解冻后，与RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清)按1：8稀释，取100 μL稀释液加入Transwell小室上层，4℃条件下风干，37℃培养箱中过夜凝固，取出备用。其余步骤与Transwell迁移实验相同。每个样品均设置3个平行反应复孔。

1.7 Western blot检测FAK和FAK Tyr397蛋白表达

收集转染后48 h细胞，胰酶消化后，将细胞裂解液加入，反复吹打以充分裂解，100℃煮沸15 min，10 000 r/min离心15 min，留取上清，BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。SDS-PAGE电泳后，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭120 min，TBST液进行洗膜，分别加入兔抗FAK、FAK Tyr397多克隆抗体(稀释比例1：2 000)，4℃孵育过夜，二抗(稀释比例1：10 000)室温下孵育60 min，TBST液冲洗3次，ECL发光液显影，拍照后以Quantity one图像分析软件对获得的条带进行分析，以β-actin为参照，计算细胞中FAK和FAK Tyr397蛋白相对表达量。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 不同转染组细胞中miR-7表达情况比较

miR-7 mimics组细胞中miR-7表达量显著高于miR-阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义(F=635.985，P<0.01)，而miR-阴性对照组细胞中miR-7表达量与空白对照组无显著差异(P>0.05)，见图1。

2.2 不同转染组细胞增殖情况比较

miR-7 mimics组接种24、48、72和96 h时细胞生长抑制率均高于miR-阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)，而miR-阴性对照组和空白对照组不同时点细胞生长抑制率无明显差异(均P>0.05)，见图2。

图1 不同转染组细胞中miR-7表达Fig.1 Expressions of miR-7 in different transfection groups

图2 miR-7 mimics转染对人胃癌SGC7901细胞增殖的影响Fig.2 Effect of miR-7 mimics on the proliferation of human gastric cancer SGC7901 cells

2.3 不同转染组细胞迁移和侵袭能力情况比较

迁移实验，每个视野中，miR-7 mimics组平均迁移细胞数(159.52±5.94)，显著低于miR-阴性对照组(315.42±7.59)和空白对照组(307.53±8.16)，差异有统计学意义(均P<0.05)，而miR-阴性对照组和空白对照组无明显差异(P>0.05)；侵袭实验，每个视野中，miR-7 mimics组平均侵袭细胞数(29.85±4.52)，显著低于miR-阴性对照组(85.42±5.59)和空白对照组(88.53±6.16)，差异有统计学意义(均P<0.05)，而miR-阴性对照组和空白对照组无显著差异(P>0.05)，见图3、图4。

A：miR-7 mimics组；B：miR-阴性对照组；C：空白对照组图3 不同转染组人胃癌SGC7901细胞的迁移能力(吉姆萨染色，×200)Fig.3 Migratory abilities of human gastric cancer SGC7901 cells in different transfection groups(Giemsa staining，× 200)

A：miR-7 mimics组；B：miR-阴性对照组；C：空白对照组图4 不同转染组人胃癌SGC7901细胞侵袭能力(吉姆萨染色，×200)Fig.4 Invasive abilities of human gastric cancer SGC7901 cells in different transfection groups(Giemsa staining，× 200)

2.4 不同转染组细胞中FAK、FAK Tyr397蛋白表达量比较

miR-7 mimics组细胞中FAK、FAK Tyr397蛋白表达量均低于miR-阴性对照组和空白对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，详见表1和图5。

表1 不同转染组细胞中FAK、FAK Tyr397蛋白表达量比较

与空白对照组比较，*P<0.05；与miR-阴性对照组比较，#P<0.05

A：miR-7 mimics组；B：miR-阴性对照组；C：空白对照组图5 不同转染组细胞中FAK、FAK Tyr397蛋白表达Fig.5 Expression of FAK and FAK Tyr397 proteins in different transfection groups

2.5 细胞中miR-7表达量与FAK、FAK Tyr397蛋白表达量相关性

Pearson相关分析显示，细胞中miR-7表达量与FAK和FAK Tyr397蛋白表达量均呈负相关(r=-0.724和-0.874，P<0.01)。

3 讨论

胃癌作为危害较大的恶性肿瘤，具有较高的发病率，且早期不易发现，致使多数患者发现时已处于中晚期，出现肿瘤侵袭、转移，因此，有必要对影响胃癌侵袭、转移的相关机制进行探讨，为早期发现、靶向治疗及控制转移提供指标或靶点。研究表明，miRNA不仅参与了肿瘤细胞增殖、凋亡及分化过程，而且参与肿瘤细胞侵袭、转移过程，与患者预后密切相关[8]。miR-7是新近发现的miRNA家族成员，其在多种恶性肿瘤中呈低表达，在抑制肿瘤细胞生长、侵袭、转移中发挥重要作用[9-10]。本研究显示，miR-7 mimics组细胞中miR-7表达量显著高于miR-阴性对照组和空白对照组，提示转染miR-7模拟物后在胃癌细胞中成功表达。

本研究显示，miR-7 mimics组接种24、48、72和96 h时细胞生长抑制率均高于miR-阴性对照组和空白对照组，说明转染miR-7模拟物提高其在胃癌SGC7901细胞中表达后，可显著抑制胃癌细胞增殖，进一步提示miR-7参与了胃癌细胞增殖过程。迁移实验中，miR-7 mimics组平均迁移细胞数显著低于miR-阴性对照组和空白对照组，侵袭实验中，miR-7 mimics组平均侵袭细胞数显著低于miR-阴性对照组和空白对照组，说明过表达miR-7可显著抑制胃癌SGC7901细胞转移、侵袭过程，提示miR-7参与了胃癌细胞侵袭和转移过程调控。郭萌萌等[11]亦发现，过表达miR-7可显著抑制肺癌细胞迁移及侵袭过程。FAK作为广泛存在于体内的非受体酪氨酸激酶，参与了多种信号通路传导，在细胞周期调控、粘附、侵袭、迁移等过程中发挥重要作用[12]，有研究指出，FAK是miR-7作用的靶基因，miR-7能够通过作用于FAK基因的3′UTR区的特定位点对其表达进行负性调节[13]。亦有研究发现，miR-7可通过抑制FAK蛋白表达而影响肿瘤细胞迁移及侵袭[14]。Tyr397是FAK的6个可被磷酸化的酪氨基位点之一，是最重要的自身磷酸化部位，其水平可直接反映FAK在细胞中活化状态[15]。本研究显示，miR-7 mimics组细胞中FAK、FAK Tyr397蛋白表达量均低于miR-阴性对照组和空白对照组，说明过表达miR-7可显著抑制胃癌细胞中FAK、FAK Tyr397蛋白表达，Pearson相关分析显示，细胞中miR-7表达量与FAK和FAK Tyr397蛋白表达量均呈负相关(均P<0.01)，进一步提示在胃癌细胞中miR-7可能通过负性调控FAK蛋白表达及磷酸化而抑制细胞迁移、侵袭过程。

综上所述，过表达miR-7可显著抑制胃癌SGC7901细胞增殖、迁移及侵袭过程，可能与其负性调控FAK蛋白表达有关，本研究有望为胃癌临床基因治疗提供新的靶位。

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(2016-04-06 收稿)

Effects of miR-7 on Proliferation，Migration and Invasion of Gastric Cancer SGC7901 Cells and Its Correlation with Focal Adhesion Kinase

Wang Jianguo1，Shi Chunyun2△，Wang Jianfei3et al

1Department of Laboratory，Affiliated Hospital of Hebei University，Baoding 071000，China2DepartmentofPediatricInternalMedicine，Children'sHospitalofBaoding，Baoding071051，China3CollegeofLifeSciences，HebeiUniversity，Baoding071000，China

Objective To investigate the effects of miR-7 on the proliferation，migration and invasion of gastric cancer cell SGC7901 and its correlation with focal adhesion kinase(FAK).Methods Human gastric cancer SGC7901 cells were cultured and divided into miR-7 mimics group，miR-negative control group and blank control group，in which cells were transfected with miR-7 mimics，miR-negative sequences and given no treatment，respectively.The expression of miR-7 was detected by using real-time PCR.The cell proliferation was tested by using MTT assay.The cell migration and cell invasion were detected by using Transwell chamber.The expression levels of FAK and FAK Tyr397 proteins were detected by using Western blotting.The correlations between the variables were analyzed by using Pearson correlation analysis.Results The expression level of miR-7 in miR-7 mimics group was(2.86±0.47)，which was significantly higher than that in miR-negative control group and blank control group(F=635.985，P<0.001)，in which the expression levels of miR-7 were(1.03±0.15)and(1.06±0.17)，respectively.The cell growth inhibition rates were higher in miR-7 mimics group than in the negative control group and blank control group at 24，48，72 and 96 h，respectively，with the differences being statistically significant(P<0.05).In the migration experiment，the average number of migrating cells in miR-7 mimics group was(159.52±5.94) per view，which was significantly lower than in miR-negative control group and blank control group[(315.42±7.59) per view and(307.53±8.16)per view ，respectively](P<0.05).In the invasive experiments，the average number of invasive cells was(29.85±4.52) per view in miR-7 mimics group，which was significantly lower than in miR-negative control group and blank control group[(85.42±5.59) per view and (88.53±6.16)per view，respectively](P<0.05).The expression levels of FAK and FAK Tyr397 proteins were lower in miR-7 mimics group than in miR-negative control group and blank control group，and the differences were statistically significant(P<0.05).Pearson correlation analysis showed that the expression of miR-7 was negatively associated with the expression of FAK and FAK Tyr397 proteins(r=-0.724 and -0.874 respectively，P<0.01).Conclusion Overexpression of miR-7 can significantly inhibit the proliferation，migration and invasion of gastric cancer SGC7901 cells possibly by negatively regulating FAK protein.

miR-7； human gastric cancer SGC7901 cells； migration； invasion； focal adhesion kinase

R735.2

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.05.009

王建国，男，1976年生，副主任检验师，E-mail：1879469320@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：1827214480@qq.com