丹酚酸B对人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型的放疗增敏效应*

向元俤， 刘卫红， 吴 娟， 李春丽， 熊 琦， 张碧波， 张 秋

华中科技大学同济医学院附属武汉市中西医结合医院 1耳鼻咽喉科，2皮肤科，武汉 430022



实验研究

丹酚酸B对人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型的放疗增敏效应*

向元俤1， 刘卫红1， 吴 娟2， 李春丽1， 熊 琦1， 张碧波1， 张 秋1

华中科技大学同济医学院附属武汉市中西医结合医院1耳鼻咽喉科，2皮肤科，武汉 430022

目的 探讨丹酚酸B(salvianolic acid B)对人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型的放疗增敏作用及可能的机制。方法 将人鼻咽癌CNE2细胞株接种于20只4～6周龄BALA/c裸鼠皮下，肿瘤长至4～6 mm时随机分为4组，分别为对照组、丹酚酸B组[20 mg/(kg·d)]、放疗组(20 Gy)、丹酚酸B [20 mg/(kg·d)]联合放疗组。各组裸鼠给予相应的处理措施，定期测量瘤体体积，4周后处死裸鼠，剥离瘤体称重，分别计算各组抑瘤率。采用流式细胞仪检测各组瘤体肿瘤细胞凋亡率；采用荧光定量PCR检测瘤体组织中HIF-1α、VEGF mRNA表达水平，采用Western blot检测瘤体组织中HIF-1α、VEGF蛋白表达水平。结果 丹酚酸B联合放疗组裸鼠移植瘤的体积和重量显著下降，相比对照组、丹酚酸B及放疗组差异均具有统计学意义(均P<0.05)；丹酚酸B联合放疗组瘤体肿瘤细胞凋亡率显著增加，相比对照组、丹酚酸B及放疗组差异均具有统计学意义(均P<0.05)；丹酚酸B联合放疗组HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白表达水平显著下降，与其他各组相比，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。结论 丹酚酸B能增强鼻咽癌裸鼠移植瘤对放疗的敏感性，其作用机制可能与降低HIF-1α、VEGF的表达，从而抑制肿瘤血管生成相关。

丹酚酸B； 鼻咽癌； 放疗敏感性； 血管内皮生长因子； 缺氧诱导因子-1α

鼻咽癌是最常见头颈部恶性肿瘤之一，其发病率在近年来显著上升[1-2]。目前，肿瘤放疗抗性是影响鼻咽癌患者临床疗效和预后的主要因素之一，如何寻找有效的方法来提高鼻咽癌患者的放疗敏感性是当前在鼻咽癌治疗中亟待解决的重要课题[3]。丹酚酸B(salvianolic acid B)是从唇形科植物丹参中提取的一种酚酸类水溶性化合物，目前被认为是丹参有效成分中含量最高、活性最强的一种[4]。既往研究报道丹酚酸B在前列腺癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤中，可发挥显著的抗肿瘤作用，其作用方式包括抑制细胞核内基因转录、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制新生血管生成等，同时对正常细胞毒性很低[5-7]。而关于丹酚酸B对肿瘤放疗敏感性的研究，国外仅有个别研究，国内尚未见报道。因此，本研究旨在探讨丹酚酸B在人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型是否存在放疗增敏作用，并进一步探讨其机制，为鼻咽癌的治疗改进寻找新的途径。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人低分化鼻咽癌CNE2细胞株来源于武汉大学典藏中心；RPIM 1640培养液购自HyClone公司，胎牛血清购自Gibco公司，青链霉素购自杭州碧云天公司；Real-time PCR试剂盒购自TaKaRa公司；SPF级BALB/c雄性裸鼠购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，鼠龄均在4～6周，体重均在16～20 g。丹酚酸B购自上海天甲公司，纯度为99%。丹酚酸B用生理盐水溶解，用0.22 μm微孔过滤器过滤，4℃保存备用。

1.2 细胞培养

人鼻咽癌CNE2细胞于RPMI 1640+10%FBS的生长培养液中，置于37℃、5% CO2饱和湿度条件下进行培养。长满后用0.25%胰蛋白酶消化液消化，传代。当CNE2细胞处于对数生长期时，取出进行实验。

1.3 裸鼠移植瘤模型建立及实验分组

取状态良好，对数生长期的CNE2细胞，待细胞贴壁达70%时，胰酶消化，离心并以0.4%锥虫蓝染色后计数，调整细胞终浓度为2.0×107个/mL。以无菌注射器吸取上述方法调整浓度的CNE2细胞悬液100 μL(含细胞2×106个)，安尔碘于裸鼠背部接种部位常规消毒，将细胞悬液接种于裸鼠右侧腋窝皮下。操作过程均在SPF无菌环境下进行。接种后定期观察，待肿瘤生长至平均直径6 mm时，按照随机数字表法，将裸鼠随机分为4组，每组5只。对照组：生理盐水腹腔注射，注射量为200 μL，每天1次，共4周；丹酚酸B组：20 mg/(kg·d)丹酚酸B腹腔注射，每天1次，共4周；放疗组：与对照组等体积生理盐水腹腔注射，注射后每周定期行电子直线加速器照射，每只每次局部5 Gy，共照射4周，共计20 Gy；放疗+丹酚酸B组：行20 mg/(kg·d)丹酚酸B腹腔注射，注射后每周定期行电子直线加速器照射，剂量与放疗组相同，共4周，共计20 Gy。腹腔注射给药后，定期(每4天1次)测量肿瘤的长径(a)和短径(b)，计算肿瘤体积(V)，公式为V=1/2(a·b)2；4周后处死裸鼠，剥离瘤体，称重并计算各组的抑瘤率。

1.4 流式细胞仪检测移植瘤肿瘤细胞凋亡率

处死裸鼠后，取部分移植瘤标本，置于盛有RPMI1640培养基的平皿中，洗涤、剪切并研碎，过滤制成单个核细胞悬液。调整细胞数量为1×105个并接种于六孔板中，以Annexin V-FITC/PI双标记法对凋亡细胞进行标记，标记步骤为：收集单细胞悬液，预冷PBS缓冲液洗涤2次，各组细胞加入1×结合缓冲液重悬细胞，每样本加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，避光孵育半小时，流式细胞仪进行检测。

1.5 Real-time PCR检测各组瘤体中HIF-1α、VEGF mRNA的表达水平

提取裸鼠移植瘤标本组织中的总RNA，紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度。RT-PCR采用TaKaRa逆转录试剂盒20 μL体系，其中RNA模板为1 μg，Oligo dT引物和随机引物各1 μL，PCR缓冲液为4 μL(包含镁离子、dNTPs、甘油等)，逆转录酶为1 μL，其余用DEPC水补足，RT-PCR反应条件为：37℃15 min，85℃5 s，4℃无限循环。Real-time PCR：本实验采用20 μL反应体系，其中模板为100 ng，HIF-1α、VEGF上下游引物各使用1 μL，TAKARA SYBR GREEN为10 μL，其余用DEPC水补足。各引物序列如下：HIF-1α引物序列，上游5′-GTGGTGGTTACTCAGCACTTT-3′和下游5′-ATCTCCGTCCCTCAACCTCT-3′；VEGF引物序列，上游5′-GAATGGGGAGCCCAGAGTG-3′和下游5′-GCAGTAGCTGCGCTGATAGA-3′；GADPH引物序列，上游5′-AAAGCCTGCCGGTGACTAA-3′和下游5′-AGGAAAAGCATCACCCGGAG-3′。Real-time PCR反应条件为：95℃预变性3 min，95℃30 s，57℃30 s，72℃30 s共计40个循环，72℃3 min，4℃无限循环，并在退火时采集荧光值。

1.6 Western blot检测各组瘤体中HIF-1α、VEGF蛋白表达水平

提取裸鼠移植瘤标本组织中的总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。配置SDS-PAGE凝胶，根据蛋白浓度，计算40 μg蛋白的上样体积。使用电泳仪接通电源，经过浓缩胶和分离胶，直至样品和溴酚蓝到达分离胶底部；使用PVDF膜200 mA转膜2 h，5%脱脂奶粉的封闭液封闭1 h；加入稀释好的一抗，4℃摇床孵育过夜；洗涤一抗后，在避光孵育盒中继续孵育二抗。孵育完毕后应用Odyssey激光成像系统扫描图像，软件半定量分析条带显影。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组瘤体的质量、体积及抑瘤率

经过不同的干预措施处理4周后，处死裸鼠并剥离各组裸鼠移植瘤瘤体称重，对照组、丹酚酸B组、放疗组和放疗+丹酚酸B组瘤体质量依次为(2.02±0.14)g、(1.68±0.09)g、(0.87±0.06)g、(0.35±0.11)g。与对照组相比，丹酚酸B组，放疗组和放疗+丹酚酸B组瘤体质量下降，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。丹酚酸B组、放疗组和放疗+丹酚酸B组的抑瘤率分别为16.8%、56.9%、82.7%，其中放疗+丹酚酸B组瘤体质量最小，抑瘤效果最为显著(P<0.01)。定期动态测量各组移植瘤体积，绘制移植瘤生长曲线，如图1，可见丹酚酸B组、放疗组和放疗+丹酚酸B组与对照组相比，瘤体体积增长速度显著降低，其中放疗+丹酚酸B组处理组瘤体增长速度下降最为显著，差异均具有统计学意义(均P<0.01)，说明丹酚酸B治疗联合放疗，可有效抑制移植瘤生长，增加裸鼠鼻咽癌移植瘤模型对放疗的敏感性。

图1 各组移植瘤生长曲线Fig.1 The growth curve of nasopharyngeal carcinoma xenografts in each group

2.2 各组瘤体肿瘤细胞的凋亡

治疗4周后，对照组、丹酚酸B组、放疗组和放疗+丹酚酸B组裸鼠移植瘤肿瘤细胞的凋亡率分别为(4.7±0.6)%，(8.9±1.2)%，(12.9±1.2)%，(35.8±0.9)%。放疗+丹酚酸B组的凋亡率显著高于对照组及其余两组，差异均具有统计学意义(均P<0.05)，说明丹酚酸B治疗联合放疗，可有效促进裸鼠鼻咽癌移植瘤细胞发生凋亡。

2.3 各组瘤体中HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表达

留取裸鼠瘤体组织标本，分别以Real-time PCR检测HIF-1α、VEGF mRNA在4组裸鼠瘤体中的表达情况，Western blot检测HIF-1α、VEGF蛋白表达情况(图2，图3)。结果显示，各实验组与对照组相比，HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白表达水平差异均具有统计学意义(均P<0.05)；同时，放疗+丹酚酸B组与单纯放疗组或丹酚酸B组相比，差异均具有统计学意义(均P<0.05)，说明丹酚酸B治疗联合放疗可下调HIF-1α、VEGF的表达。

n=5；与对照组比较，*P<0.05；与放疗组比较，#P<0.05；与丹酚酸B组比较，△P<0.05图2 Real-time PCR检测各组移植瘤HIF-1α、VEGF mRNA表达变化Fig.2 HIF-1α and VEGF mRNA expression measured by real-time PCR

①对照组；②丹酚酸B组；③放疗组；④放疗+丹酚酸B组；n=5；与对照组比较，*P<0.05；与放疗组比较，#P<0.05；与丹酚酸B组比较，△P<0.05图3 Western blot检测各组移植瘤HIF-1α、VEGF蛋白表达Fig.3 Western blot analysis of HIF-1α and VEGF protein expression

3 讨论

鼻咽癌是常见的头颈部恶性肿瘤之一，具有显著的种族、地域差异及多因素病因学特点。尽管在全世界大部分地区鼻咽癌的发病率低于百万分之一，但在我国华南地区，尤其是广东、广西等地，鼻咽癌具有极高的发病率，可达10/10万～25/10万，并且这一比例仍然在不断增长[8-9]。鼻咽癌对放射线的高敏感性以及鼻咽部特殊的解剖结构和生物学特点，决定了对鼻咽癌治疗的主要方法是放射治疗[10]。但是因肿瘤的放射抗拒、放疗后肿瘤复发、放疗本身的毒副作用以及鼻咽部解剖结构的限制等问题的存在，鼻咽癌患者的放疗疗效受到了严重的影响[11]。因此，寻找新的方法来提高鼻咽癌对放射治疗的敏感性，成为在鼻咽癌治疗中亟待解决的关键问题。

近年来，关于中草药提取物中的有效成分发挥抗肿瘤作用的研究，逐渐成为国内外学者们的关注热点。丹酚酸B又称丹酚酸乙，为一分子咖啡酸与三分子丹参素缩合而成，是丹参有效水溶性成分中含量最高、药理活性最强的一种。丹酚酸B显著的抗肿瘤作用已在多篇国内外研究中得到了报道[12-13]。目前国内外对丹酚酸B抗肿瘤的研究多集中在体外研究。体外实验与体内环境差异较大，难以真实地模拟药物在体内的代谢及作用，因此，本研究成功构建鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤模型，探究丹酚酸B是否在动物体内存在放疗增敏作用。研究结果发现，在腹腔注射丹酚酸B联合放疗4周后，裸鼠的移植瘤瘤体质量和体积显著下降，相对对照组、丹酚酸B组和放疗组差异均具有统计学意义(均P<0.05)，抑瘤率达到82.7%，同时，丹酚酸B联合放疗组裸鼠瘤体肿瘤细胞的凋亡率也有显著的增加，由此说明丹酚酸B治疗联合放疗，可有效增加裸鼠鼻咽癌移植瘤模型对放疗的敏感性，促进肿瘤细胞凋亡。

为进一步研究其作用机制，我们采用Real-time PCR检测各组瘤体组织中HIF-1α、VEGF mRNA的表达变化。研究结果显示，与对照组相比，放疗组裸鼠瘤体中HIF-1α、VEGF mRNA表达水平上升，而丹酚酸B组联合放疗组HIF-1α、VEGF mRNA表达水平下降，与对照组及放疗组相比，差异均具有统计学意义(P<0.05)。恶性肿瘤的生存、生长和转移有赖于肿瘤的新生血管生成。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种具有高度特异性的，在血管生成过程中起着关键作用的细胞因子，在多种肿瘤如乳腺癌、食管癌、肺癌中特异性高表达[14-15]。VEGF是HIF-1α的重要靶基因之一，在缺氧条件下，VEGF基因启动子区域能与HIF-1α DNA结合，从而激活相关信号通路，促进肿瘤血管生成[16]。大量研究表明，放疗时造成的乏氧环境可引起肿瘤细胞内VEGF表达升高，从而引起相关信号通路的激活，促进肿瘤血管生成，而肿瘤血管形成又可造成放射敏感性下降，引起放射抗拒[17-18]。因此，抑制肿瘤血管生成，是解决肿瘤放疗抵抗的有效措施。我们的研究结果发现放疗组瘤体中VEGF水平相比对照组有所增加，提示放疗可促进鼻咽癌瘤体的血管生成及增加HIF-1α和VEGF表达水平；而丹酚酸B联合放疗组HIF-1α和VEGF水平较其他各组显著下降，且差异有统计学意义，提示放疗联合丹酚酸B对鼻咽癌有明显的抑瘤作用，这可能与丹酚酸B增加放射敏感性，降低了VEGF的表达有关，为鼻咽癌的放射增敏治疗提供了实验依据。

综上所述，本研究发现丹酚酸B对人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型存在显著的放疗增敏作用，进一步机制研究发现其作用可能是通过抑制放疗时HIF-1α、VEGF的表达，从而抑制肿瘤血管生成来实现的。放疗耐受是影响鼻咽癌患者治疗和预后的主要因素之一。丹酚酸B可有效地增加鼻咽癌的放疗敏感性，具有相当可观的抗肿瘤潜能。本研究结果将为今后关于鼻咽癌的放疗增敏剂临床运用提供实验依据，有助于进一步提高鼻咽癌患者的放、化疗效果，完善肿瘤治疗的临床方案。

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(2016-05-23 收稿)

Salvianolic Acid B Enhances Radiosensitivity of Nasopharyngeal Carcinoma Xenografts in Nude Mice

Xiang Yuandi1，Liu Weihong1，Wu Juan2，et al

1Department of Otorhinolaryngology，2Department of Dermatology，Wuhan Hospital ofIntegratedTraditionalChineseMedicineandWesternMedicine，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

Objective To investigate the role of salvianolic acid B in the radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma xenografts in nude mice.Methods CNE2 cells(a human nasopharyngeal cell line)were inoculated into 4-6 week old BALA/c nude mice.When the xenografts grew to 4-6 cm，nude mice(n=20)were randomly divided into 4 groups：normal control(NC)group，salvianolic acid B [20 mg/(kg·d)] group，radiotherapy(20 Gy)group，salvianolic acid B [20 mg/(kg·d)]plus radiotherapy(20 Gy)group.After 4-week treatment，the tumor volume and weight were obtained，and the tumor inhibition rate was calculated.Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of tumors，real-time PCR to detect the expression of HIF-1α and VEGF mRNA in tumors，and Western blotting to measure the expression of HIF-1α and VEGF protein in tumors.Results The volume and weight of the xenograft tumors were significantly decreased and the apoptosis rate of the xenograft tumors was obviously increased in salvianolic acid B plus radiotherapy group as compared with those in NC group，salvianolic acid B group and radiotherapy group(P<0.05 for all).The mRNA and protein expression levels of HIF-1α and VEGF were significantly lower in salvianolic acid B plus radiotherapy group than in other groups(P<0.05).Conclusion Salvianolic acid B can enhance the sensitivity of radiotherapy to the nasopharyngeal carcinoma xenografts in nude mice and the mechanisms may involve the suppression of HIF-1α and VEGF expression and thereby the tumor angiogenesis.

salvianolic acid B； nasopharyngeal neoplasms； radiosenstivity； VEGF； HIF-1α

*武汉市卫生局2016年科研基金资助项目(No.WX16E27)

R766.9

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.05.012

向元俤，男，1980年生，主治医师，医学硕士，E-mail：doctorxiangwuhan@163.com