兔出血症病毒2型的VP60基因保守区人工合成及RT-PCR检测方法初探

杨泽晓，赵希仑，李 岩，王 波， 姚学萍，王 印，3，*，耿 毅，蒙正群，白 瑜

(1.四川农业大学 动物医学院， 四川 温江 611130； 2.四川农业大学 动物科技学院， 四川 温江 611130； 3.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 温江 611130)



兔出血症病毒2型的VP60基因保守区人工合成及RT-PCR检测方法初探

杨泽晓1，赵希仑1，李 岩2，王 波1， 姚学萍1，王 印1，3，*，耿 毅1，蒙正群1，白 瑜1

(1.四川农业大学 动物医学院， 四川 温江 611130； 2.四川农业大学 动物科技学院， 四川 温江 611130； 3.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 温江 611130)

为建立用于兔出血症病毒2型(RHDV2)的快速检测方法，根据GenBank已公布的RHDV和RHDV2VP60基因，设计合成2对特异性引物和10条末端重叠引物，通过重叠PCR 人工合成RHDV2VP60基因中保守区片段，构建重组质粒，并以其为模板，经过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验和35份样品检测应用，初步建立RHDV2 RT-PCR检测方法。实验成功合成RHDV2VP60基因的435 bp保守片段并构建了pMD-19T-RHDV2重组质粒， 初步建立的RHDV2 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性，RHDV2的检测限度可达到230个拷贝的靶基因片段，检测RHDV、pGM-T-EBHSV(已构建)、兔巴氏杆菌、兔源大肠埃希菌和沙门氏菌均无特异性扩增，样品检测结果显示样品中RHDV2核酸阴性。该研究为中国及时进行RHDV2的防控提供技术储备。

兔病毒性出血症；RHDV2；RT-PCR；重叠PCR

兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease，RHD)，俗称兔瘟，自1984年我国首次报道后，世界很多国家也发生并流行[1]。RHD由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起，是兔的一种急性、高度致死性传染病。它主要危害2月龄以上多个家兔品种的成年兔子，并以呼吸系统出血，实质器官淤血、肿大、出血和肝脏坏死为主要特征性病变，此病潜伏期短、发病急、病程短、传播快、死亡率高达100%，严重威胁着世界养兔业的发展[1-3]。由于灭活苗等多种防控措施的广泛使用，该病得到了一定程度的控制。然而，在2010年法国出现了一种新型兔病毒性出血症(new rabbit hemorrhagic disease，nRHD) ，该病与经典兔瘟病理相似，平均死亡率虽然只有20%左右，但是能感染致死30 日龄以内的兔子，并可突破传统RHDV毒株灭活苗的免疫保护作用[4-5]。研究表明，这种nRHD病原是一种新RHDV变异株即兔出血症病毒2型(rabbit hemorrhagic disease virus type 2，RHDV2)，或者称兔出血症病毒b型(rabbit hemorrhagic disease virus variant b，RHDVb)[5]。RHDV2毒株，与包括G6基因型的RHDVa毒株[6]在内的传统RHDV毒株不同，它们与传统RHDV毒株的核苷酸序列同源性仅为82.4%左右[5，7]，且还可感染一些野兔属兔子品种，较传统RHDV毒株感染范围更广[8-9]，对养兔业的威胁不亚于RHDV。近年来，该病已迅速扩散至意大利、西班牙、葡萄牙、德国、英国等多个西欧大陆国家和亚速尔群岛[5，8，10-14]，呈现出向外蔓延的趋势。随着兔子引种、及其相关产品等国际经济贸易的发展，进行RHDV2的检测方法等防控技术研究，加强检验检疫已经显得非常重要和必需。目前我国尚未见关于RHDV2发生及其防控相关研究的公开报道。为此，本研究拟通过对RHDV和RHDV2分子生物学信息的收集分析和引物设计，采用重叠PCR技术人工合成RHDV2的VP60保守区基因片段，进而进行其RT-PCR检测方法的初步研究，以期为我国RHDV2的检测技术研究提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与样品

Pfu DNA polymerase， 2×TaqMaster Mix， pMD-19T Vector Kit(VT202-01)， TIANprep Mini Plasmid Kit(DP103)和 TIANgel Midi Purification Kit(DP209)均为成都飞克生物科技有限公司产品；DNA Maker DL2000、RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT Reagent Kit (RR037A) 均为大连宝生物工程有限公司产品；兔巴氏杆菌、兔大肠埃希菌、兔沙门氏菌、欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)重组质粒pGM-T-EBHSV和兔出血病病毒(RHDV-Sch01株)人工感染病料由四川农业大学动物检疫实验室保存。

1.2 引物设计

根据GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库登录的RHDV和RHDV2的VP60基因序列分析，采用DNAStar软件分别设计4条特异性引物和10条重叠PCR延伸引物(表1)，送上海英潍捷基贸易有限公司合成，按照合成说明书将其稀释至10 μmol·L-1，-20 ℃冻存备用。

1.3 RHDV2 VP60基因靶片段的人工合成

按照参考文献[15]操作，采用搭桥PCR技术进行RHDV2VP60靶基因片段的人工合成。首先利用每对重叠PCR引物(F1/R1， F2/R2， F3/R3， F4/R4 和F5/R5)进行初级延伸反应，体系为：10×Pfu 缓冲液 5 μL， dNTP(2.5 mmol·L-1)8 μL，重叠PCR引物(10 μmol·L-1)各1 μL，Pfu DNA 聚合酶1 μL和 34 μL ddH2O；反应程序为95 ℃ 30 s，72 ℃ 15 min。接着依次分别取两个相邻的前一次重叠延伸反应产物各20 μL，10×Pfu 缓冲液1 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)8 μL，Pfu DNA 聚合酶1 μL混匀进行次级延伸反应，至最终模板延伸结束，反应程序同上。

表1 RHDV2 RT-PCR与重叠PCR的引物

Table 1 Primers used in this study

项目和引物编号TaskandPrimername引物序列(5'-3')Primersequence(5'-3')产物大小Productsize/bp参考序列ReferencesequenceRHDVRT-PCR P1GGGTGTCATATCCACCCCAAA(6573-6593)441DQ205345 P2CCCAGGTTGAACACGAG(7013-6997)RHDV2RT-PCR FCATATCCACCCCAAAYAGT(6539-6557)435KP129339 RCCCAARTTGTACACAAGC(6973-6956)RHDV2OverlapextensionPCR F1TATCCACCCCAAACAGTAATGCCGTCACGTACACACCTCAGCCAAACAGGAKP129339 F2GCTCCTATTGGCAAGAACACACCCATCAT-GTTCGCGTCTGTTGTTAGGCGCACCGGCGA F3GAACCCAGTACGGCGCGGGATCACAAC-CACTGCCGGTGACAGTTGGACTCTCACTGAAC F4GTTCTTTGTTTGGCAGCTGAATTTCGCT-TCCGGTTTCATGGAACTTGGCTTGAGTGTTG F5TCAGCCACCCTCATTGACCTGTCAGAACT-TGTTGACATCCGCCCTGTGGGACCCAGACC R1CTTGCCAATAGGAGCGGCAGCAGGGGTGC-CAGGTGCATTGACAATCCTGTTTGGCTGAG R2CGCCGTACTGGGTTCCGTTAGCTGAACCG-GCCTCAGCGTTGATGTCGCCGGTGCGCCTA R3TGCCAAACAAAGAACTGCCCAGGCATA-AGTGCCGACGAGTAATTGTTCAGTGAGAGTCC R4AATGAGGGTGGCTGAAGCCCCCGTCCCTG-CATAGAAGTACCCATCAACACTCAAGCCAA R5CCCAAGTTGTACACAAGCGTGCTTGTGGACGGTCTGGGTCCCACA

分别以最终次级延伸反应产物和F/R为模板与引物，进行PCR。其反应体系为：2×Taq Master Mix 25 μL，F/R (10 μmol·L-1)各1 μL ，最终次级延伸反应产物5 μL和ddH2O 18 μL。反应程序为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 8 min。反应结束后取5 μL产物进行凝胶电泳分析。

用TIANgel Midi Purification Kit(DP209)纯化回收预期大小的PCR产物；然后按照pMD-19T Vector Kit说明书进行连接转化，挑取Amp+LB平板上的阳性克隆扩增培养，按照TIANpre Mini Plasmid Kit(DP103)说明书抽提质粒按照上述反应程序同时进行pMD-19T Vector通用引物(MR13-47/ RV-M)和特异性引物(F/R)的PCR鉴定，并将PCR鉴定均为阳性的重组质粒送北京擎科新业生物技术有限公司进行序列测定。

1.4 RHDV VP60基因靶片段的克隆鉴定

按照RNAiso Plus reagent 说明书操作，提取RHDV人工感染组织病料中总RNA，使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit进行反转录(RT)，取5×Primerscript buffer 2 μL，Oligo dT Primer(50 μmol·L-1)0.5 μL，ddH2O 4.0 μL，Primerscript RT Enzyme Mix 0.5 μL，Random 6 mers(100 μmol·L-1)0.5 μL和总RNA 2.5 μL，混匀，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。反应结束后取2 μL RT产物(其余产物保存 -20 ℃备用)，以P1/P2为引物，采用1.3节的PCR反应体系与程序进行PCR扩增。按照1.3节的方法步骤进行RHDV PCR产物的纯化回收，连接转化和重组质粒的PCR鉴定与测序分析。

1.5 反应条件的优化

以1.3节中构建的RHDV2阳性重组质粒为模板，以F/R为引物，进行PCR退火温度(54～60 ℃)和反应时间等条件的优化。

1.6 RHDV2 RT-PCR敏感性试验

抽提1.3节中构建的RHDV2阳性重组质粒，用ND-2000紫外分光光度计定量后进行10倍梯度稀释，按照1.5节确定的反应条件进行PCR扩增。

1.7 RHDV2 RT-PCR特异性试验

按照1.5节确定的反应条件分别以1.4节中RHDV RNA的反转录产物(cDNA)、RHDV2 阳性重组质粒、pGM-T-EBHSV、兔巴氏杆菌、兔大肠埃希菌、兔沙门氏菌为模板进行PCR特异性检测。

1.8 初步应用试验

利用建立的RHDV2 RT-PCR方法对5份RHDV人工感染病料样品和30份临床收集的病死兔子检样进行了检测。

2 结果与分析

2.1 RHDV2和RHDV靶基因片段的克隆鉴定

按照1.3节操作经过初级延伸反应、次级延伸反应和PCR人工合成出一段与预期大小(435 bp)相符的DNA条带(图1，泳道1)，同时按照1.4节操作采用RT-PCR技术对人工合成靶片段对应的RHDV基因片段进行了扩增，结果(图1，泳道2)扩增出预期大小(441 bp)的特异性条带，然后纯化回收2 种目的条带、分别进行连接转化、重组菌的挑取、重组质粒的抽提和PCR鉴定(图2)，两种重组质粒的载体通用引物(MR13-47/ RV-M)的PCR产物均稍大于其特异性引物的PCR产物，表明目的片段与pMD-19T载体连接成功，选取PCR鉴定阳性的重组质粒进行序列测定，将测序结果BLAST分析显示人工合成的基因片段、RT-PCR扩增片段分别与GenBank 中公布的RHDV2(KP129339)、RHDV(KF537692)序列同源性均为100%。表明成功克隆了RHDV2与RHDV两种病毒的VP60基因靶片段，并将构建的重组质粒分别命名为pMD-19T-RHDV2和pMD-19T-RHDV。

M，DNA marker DL2000；1， RHDV2靶基因重叠PCR产物；2，RHDV靶基因RT-PCR产物；3，RHDV靶基因RT-PCR阴性对照M， DNA marker DL2000; 1， RHDV2 overlapping extension PCR products; 2， RHDV RT-PCR products; 3， RHDV RT-PCR negative control图1 RHDV2和RHDV靶基因片段的克隆Fig.1 Amplification results of target DNA fragments of RHDV2 and RHDV

M，DNA marker DL2000；1，pMD-19T-RHDV 特异性引物(P1/P2)PCR产物；2，pMD-19T-RHDV 通用引物(MR13-47/ RV-M)PCR产物；3，pMD-19T-RHDV2特异性引物(F/R)PCR产物；4，pMD-19T-RHDV2通用引物(MR13-47/ RV-M)PCR产物；5，pMD-19T空载体通用引物(MR13-47/ RV-M)PCR产物M， DNA marker DL2000; 1， PCR products amplified from pMD-19T-RHDV(P1/P2); 2， PCR products amplified from pMD-19T-RHDV (MR13-47/ RV-M); 3， PCR products amplified from pMD-19T-RHDV2 (F/R); 4， PCR products amplified from pMD-19T-RHDV2 (MR13-47/RV-M); 5， PCR products amplified from pMD-19T vector (MR13-47/RV-M)图2 两种靶基因片段重组质粒的PCR鉴定Fig.2 PCR identification results of 2 recombinant plasmids

2.2 反应条件的优化

按照1.5节操作进行退火温度的优化，结果如图3所示，每个退火温度条件下均扩增出约435 bp的特异性DNA条带，泳道1—4扩增产物量没有明显差异，都较泳道5—7条带亮，因此泳道4(58 ℃)的退火温度较理想，考虑反应的特异性和反应时间，将PCR反应条件确定为95 ℃预变

M，DNA marker DL2000；1，54.0 ℃；2，55.2 ℃；3，56.3 ℃； 4，58.0 ℃； 5，58.8 ℃；6，59.5 ℃；7，60.0 ℃图3 RHDV2 RT-PCR退火温度的优化Fig.3 Test results of annealing degree for RHDV2 RT-PCR

性5 min；95 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。RT反应的体系和条件按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit说明书进行。

2.3 RHDV2 RT-PCR的敏感性和特异性

按照1.6节、1.7节操作抽提pMD-19T-RHDV2，分别进行RT-PCR的敏感性和特异性试验。敏感性检测结果如图4所示，RHDV2检测限度可达230个拷贝的目的基因(泳道4)；特异性检测结果如图5所示，除pMD-19T-RHDV2(泳道1)扩增出435 bp特异性目的条带外，RHDV cDNA、pGM-T-EBHSV、兔巴氏杆菌、兔大肠埃希菌、兔沙门氏菌的PCR扩增均为阴性，表明了建立的RHDV2 RT-PCR 的良好特异性与敏感性。

2.4 样品检测

按照1.8节的操作对5份RHDV人工感染RHDV病料样品和30份临床收集的兔子病料进行了检测，结果显示所有检样的RHDV2VP60基因靶片段核酸均为阴性。

M， DNA marker DL2000；1， 2.3×105 copies；2， 2.3×104 copies；3， 2.3×103 copies；4， 2.3×102 copies；5， 23 copies；6， 阴性对照Negative control图4 RHDV2 RT-PCR敏感性检测结果Fig.4 The sensitivity assay results of RHDV2 RT-PCR

M，DNA marker DL2000；1，pMD-19T-RHDV2；2，RHDV；3，pGM-T-EBHSV；4，兔巴氏杆菌；5，兔大肠埃希菌；6，兔沙门氏菌；7，阴性对照(ddH2O模板)M， DNA marker DL2000; 1, pMD-19T-RHDV2; 2， RHDV; 3， pGM-T-EBHSV; 4， Pasteurella multocida; 5， Escherichia.coli; 6， Salmonella; 7， Negative control(ddH2O).图5 RHDV2 RT-PCR特异性检测结果Fig.5 Specificity assay results of RHDV2 RT-PCR

3 讨论

RHDV于1984年被发现后，归为嵌杯病毒科兔病毒属。后来该属成员不断被发现，包括欧洲野兔综合症病毒(EBHSV)、包含RCV-A1株(澳大利亚)、MRCV株(美国)和06-11株(法国)等毒株的非致病(低毒)兔病毒(NP-LV)、其他病毒成员[7]，以及2010年以后出现RHDV2[4]，它们均为单链正股RNA病毒，具有相似的基因组成结构与大小和一定的遗传关系，VP60基因同源性分析显示，RHDV2毒株间遗传相对稳定，其基因同源性在99%以上，RHDV2与RHDV的基因同源性为85%[7]，其他NP-LV毒株与RHDV毒株变异率低于20%，与EBHSV毒株间的变异率低于30%[12]。通过基因序列分析，研究者们根据基因同源性分析将RHDV不同毒株分为G1-G6 6个基因型(群)，目前，我国报道流行RHDV毒株主要为G6型毒株，属于RHDVa型毒株[16]。虽然不同基因型RHDV毒株间也存在一定抗原性的改变，但仍属一种血清型，可被传统疫苗防控。RHDV2则可以感染致死传统RHDV毒株疫苗免疫过的兔子[12]，因此加强RHDV2防控技术研究以加大检疫力度将是防止其传入我国的最为有效措施之一。2015年Margarida等[17]根据RHDV2VP60基因保守区建立了一种用于RHDV2检测的TaqMan探针荧光RT-PCR，具有良好敏感性和特异性，但是需要专用设备荧光PCR仪，一般的实验室无法进行。由于国内没有RHDV2感染的发生，获取研究材料比较困难也有传播风险，国内尚无相关研究的报道。本研究在对RHDV2分子生物学信息分析的基础上采用重叠PCR技术人工合成了其VP60基因的保守区片段，并对RHDV2的RT-PCR方法进行了初步探索。

重叠PCR技术作为一种基因人工合成的生物工程技术可以根据已有的基因序列设计搭桥引物，利用重叠延伸和PCR获取目的基因片段，方便可靠，已被用作缺少病原体和避免高危病原体扩散条件下的分子生物水平相关研究包括分子生物学诊断方法的研究[15，18-19]。本研究根据RHDV2一段435 bp 的VP60基因保守序列，设计合成10条重叠延伸引物和1对特异性引物(表1)利用重叠PCR技术成功对其进行了人工合成，为进行RT-PCR检测方法的研究提供了模板。考虑到无法进行RHDV2对建立RT-PCR方法实用性的验证，我们同时根据RHDV2扩增靶片段在RHDVVP60基因相应的位置设计了与RHDV2 RT-PCR引物对应的RHDV扩增引物(P1/P2)，通过对RHDVVP60的与RHDV2靶基因片段对应基因片段的成功RT-PCR来间接验证了RHDV2 RT-PCR引物的可靠性，解决了缺乏RHDV2病毒材料验证问题。同时本研究通过退火温度的优化确立了反应条件，并进行了特异性检测、敏感性试验和临床检样的初步应用，结果显示确立的RHDV2 RT-PCR反应条件和体系检测限度可达230个拷贝的RHDV2目的基因，除阳性对照能扩增出435 bp特异性DNA条带外，检测RHDV、pGM-T-EBHSV、兔巴氏杆菌、兔大肠埃希菌等主要病原均无特异性扩增，提示建立的RHDV2 RT-PCR 具有良好特异性与敏感性，这为我国进行RHDV2防控相关研究提供了科学参考，也为RHDV2检验检疫和流行病学调查提供了一种快速检测的技术储备。

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(责任编辑 卢福庄)

Artificial synthesis ofVP60 conserved gene fragment of rabbit hemorrhagic disease virus type 2 and preliminary study of its RT-PCR detection method

YANG Ze-xiao1， ZHAO Xi-lun1， LI Yan2， WANG Bo1， YAO Xue-ping1， WANG Yin1，3，*， GENG Yi1， MENG Zheng-qun1， BAI Yu1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Wenjiang611130，China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，SichuanAgriculturalUniversity，Wenjiang611130，China; 3.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，Wenjiang611130，China)

In order to develop a rapid detection method for RHDV2， 4 specific primers and 10 overlapping oligo primers were designed to amplify the conserved RHDV2VP60 gene specific DNA fragment according to the genome sequences of RHDV and RHDV2 published in GenBank. Based on the synthesis of a conserved part of RHDV2 sequence using overlap extension PCR and the construction of recombinant plasmid， RT-PCR assay was firstly established and evaluated in China after a series of tests， including optimization of reaction conditions， sensitivity and specificity tests， and the application tests of 35 samples. It was shown that a 435 bp specific DNA fragment of the RHDV2 capsid protein (VP60) gene was synthesizedinvitroand the recombinant plasmid pMD-19T-RHDV2 was constructed. The sensitivity of the established RT-PCR detection method for RHDV2 could reach about 230 copies of cloned viral genomic fragments of RHDV2， and there was no amplification for RHDV， pGM-T-EBHSV，Pasteurellamultocida，EscherichiacoliandSalmonellafrom rabbits by this method. Besides， the application results showed that there were not RHDV2 in the experimental infection RHDV samples and clinical samples. The present research set basis for RHDV2 control study and supplied a back-up method for the rapid detection and prevention of RHDV2.

rabbit hemorrhagic disease; RHDV2; RT-PCR; overlap extension PCR

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.10.04

2016-01-11

国家自然科学基金项目(31402222)；“十二五”国家科技支撑计划(2013BAD12B04)；教育部《“长江学者和创新团队发展计划”》创新团队项目(IRT0848)；四川农业大学双支计划；四川省科技支撑计划(2016N20002)

杨泽晓(1980—)，男，河南南阳人，博士，副教授，研究方向为动物疫病防治与兽医公共卫生。E-mail: yzxyang2003@126.com。

*通信作者，王印，E-mail: yaanwangyin@tom.com

S855.3;S829.1

A

1004-1524(2016)10-1650-07

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(10): 1650-1656

杨泽晓，赵希仑，李岩，等. 兔出血症病毒2型的VP60基因保守区人工合成及RT-PCR检测方法初探[J].浙江农业学报，2016，28(10): 1650-1656.