叶用甜菜染色体制片条件优化及核型分析

孙 勃，田玉肖，夏 雪，李梦娇，罗玲玲，李 琳，陈 清，张 芬，汤浩茹

(四川农业大学 园艺学院，四川 成都 611130)



叶用甜菜染色体制片条件优化及核型分析

孙 勃，田玉肖，夏 雪，李梦娇，罗玲玲，李 琳，陈 清，张 芬，汤浩茹*

(四川农业大学 园艺学院，四川 成都 611130)

以叶用甜菜绿梗品种为材料，对影响染色体制片效果的解离时间、预处理时间和取材时间等条件进行优化，并进行核型分析。结果表明，1 mol·L-1HCl 60 ℃解离12 min，染色体着色良好而且细胞质透明，对比度高；0.002 mol·L-18-羟基喹啉预处理9 h染色体收缩性最好，形态最佳，分散性好；上午9：00取材，分裂相细胞和中期分裂相细胞最多。叶用甜菜的染色体数目为2n=2x=18，核型公式为2n=2x=18=16m+2sm(2SAT)，染色体长度比为1.52，染色体相对长度组成为8M2+10M1，染色体相对长度变化范围为8.75%～13.29%，着丝粒指数变化范围为36.67%～47.04%，臂比值变化范围为1.13～1.73，其中，第2对染色体为近中部着丝粒染色体(sm)，且具有随体，其余均为中部着丝粒染色体(m)，核型不对称系数为58.50%，核型分类标准属1A型。同时，该研究还比较了叶用甜菜与已报道的糖用甜菜的核型结果，发现两者在核型公式、核型分类、随体和核型不对称系数等方面存在明显差异。研究结果从细胞遗传学角度揭示叶用甜菜的核型特征，为今后进行不同类型叶用甜菜的核型比较提供理论依据。

叶用甜菜；染色体；制片优化；核型分析

叶用甜菜(BetavulgarisL. var.ciclaL.)为藜科(Chenopodiaceae)甜菜属(Beta)甜菜种的变种[1]，别名牛皮菜、莙荙菜、厚皮菜等，原产欧洲地中海沿岸，我国叶用甜菜主要分布于西南地区及长江黄河部分流域。叶用甜菜易于栽培，产量高并稍耐暑热，是我国西南地区夏季常见的食用叶菜，鲜嫩多汁，适口性好。叶用甜菜叶片富含还原糖、粗蛋白、纤维素等营养成分及维生素C、钾、铁等微量元素[2]，现代药理学研究还表明，叶用甜菜萃取物具有降血压、降血糖和抗氧化活性等保健功效[3]。

核型分析是一种重要的细胞学研究手段，广泛地应用于物种发育进化及物种间亲缘关系的研究[4-5]。陈瑞阳等[6]报道了同为甜菜属的糖用甜菜的核型，发现其同时具有2倍体、3倍体和4倍体。但迄今为止，关于叶用甜菜的核型尚未见报道。本试验以叶用甜菜绿梗品种为材料，首先对其染色体制片的关键步骤进行条件优化，之后采用最佳制片条件进行叶用甜菜的核型分析，并与已报道的糖用甜菜核型结果进行比较，从细胞遗传学角度揭示叶用甜菜的核型特征，也为今后进行不同类型叶用甜菜的核型比较提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试叶用甜菜为产自甘肃的绿梗品种中农。

1.2 试验方法

本试验以叶用甜菜绿梗品种的根尖为材料，于2015年6月—9月在四川农业大学园艺学院遗传育种实验室进行。挑选籽粒饱满的叶用甜菜种子4 ℃条件下保存4 d，之后放入铺有双层湿润滤纸的培养皿中，于培养箱中暗培养，25 ℃/16 h和18 ℃/8 h交替进行。4 d后当主根长度至10～15 mm时，以每30 min为1个时间间隔，于上午8：00—11：00剪取根尖，以确定最适的取材时间(预处理9 h，解离12 min)；4 ℃条件下以0.002 mol·L-18-羟基喹啉溶液分别预处理1、3、6、9、12和15 h，以确定最优预处理时间(上午9：00取材，解离12 min)。将预处理好的材料置于V(冰醋酸)∶V(无水乙醇)=1∶3的卡诺固定液4 ℃固定24 h，之后分别用95%、85%和75%的乙醇溶液梯度洗脱，最后保存在75%的乙醇溶液中。解离采用酸解法，将保存好的根尖用1 mol·L-1HCl 60 ℃分别解离1、4、8、12、16和20 min，以确定最优解离时间(上午9：00取材，预处理9 h)。之后用蒸馏水清洗3次，切取叶用甜菜根尖分生区部分于载玻片上，卡宝品红染液染色5～10 min，常规压片后镜检，将装片中染色体形态及分散良好的中期分裂相细胞在Olympus CX21光学显微镜100倍油镜下观察并拍照。

染色体计数选取30个染色体数目清晰的中期分裂相细胞进行，核型分析采用李懋学等[4]提出的标准，确定着丝粒位置，根据染色体的大小和形态特征对染色体核型进行配对分析，染色体的相对长度、臂比及类型按照Levan等[7]的命名法则计算，着丝粒指数和染色体相对长度系数参照李懋学等[4]的标准计算，核型不对称系数采用Arano[8]的方法计算，核型类型按照Stebbins[9]的标准划分。

2 结果与分析

2.1 染色体制片条件的优化

2.1.1 解离时间对制片效果的影响

对不同解离时间对叶用甜菜染色体制片效果的影响进行了分析，各处理统一在上午9：00取材，预处理9 h。由图1可知，60 ℃ 1 mol·L-1HCl解离1和4 min，解离不够充分，细胞内部的染色体不易分散，根尖外部的细胞染色体和细胞质均着色较深，对比度低，内部的细胞由于接触不到染液而无法着色，导致不易进行染色体观察和分析(图1-A、B)；解离8和12 min，细胞较为分散，染色体着色良好且细胞质趋于透明，对比度高(图1-C、D)，相比之下，解离12 min效果最佳(图1-D)；解离16和20 min，解离程度逐渐过度，不仅细胞质不易着色，而且细胞中的染色体也不易着色，从而导致染色体颜色太浅，不利于进行后续的观察和分析(图1-E、F)。综上可知，12 min为最佳解离时间。

A—F分别表示解离时间1、4、8、12、16、20 min。标尺代表10 μm，下图同A-F represent 1， 4， 8， 12， 16， 20 min of dissociation times used， respectively. The scale plate represents 10 μm， and the same as the figures below图1 不同解离时间处理的叶用甜菜染色体图 (×1 000)Fig.1 Chromosomes of leaf beet under different dissociation times (×1 000)

2.1.2 预处理时间对制片效果的影响

不同预处理时间对叶用甜菜染色体制片效果存在明显影响，所有处理均在上午9：00取材，解离时间均为12 min。结果如图2所示，预处理1和3 h，染色体细长，固缩程度明显不足，同时染色体分散性差，且拖尾现象严重(图2-A、B)；预处理6 h染色体分散程度和固缩程度均有所改善，但拖尾现象仍存在，结果不够理想(图2-C)；预处理9 h，染色体分散性较好，同时收缩性最好，形态最佳，均呈现X型，着丝粒清晰可见(图2-D)；预处理12和15 h，染色体分散性好，但大部分染色体固缩加重，部分染色体甚至固缩过度呈点状，已不适合用于核型分析(图2-E、F)。综上，预处理9 h的染色体最适合用于叶用甜菜染色体的核型分析。

A—F分别表示预处理时间1、3、6、9、12、15 hA-F represent 1， 3， 6， 9， 12， 15 h of pretreatment times used， respectively图2 不同预处理时间处理的叶用甜菜染色体图(×1 000)Fig.2 Chromosomes of leaf beet under different pretreatment times (×1 000)

2.1.3 取材时间对分裂相细胞数的影响

取材时间对叶用甜菜染色体制片也存在明显影响。由图3可见，不同取材时间，分裂相细胞百分比和中期分裂相细胞百分比存在显著差异。上午9：00取材的处理分裂相细胞百分比最高，达到38.5%，其次是9：30和10：00，三者间无显著性差异；而上午8：00取材的处理分裂相细胞百分比最低，仅为15.8%。而中期分裂相细胞百分比统计结果仍以上午9：00比例最高，为6.2%，显著高于其他各处理。综合分裂相和中期分裂相细胞统计结果可知，上午9：00取材的处理分裂相和中期分裂相细胞最多，最易筛选出分散良好的染色体分裂相。因此，上午9：00是叶用甜菜染色体制片的最佳取材时间，后续的研究也采用该时间作为取材时间。

柱状图上无相同小写字母表示在P<0.05水平差异有统计学意义Values without the same lower letters indicate significant difference at the level of 0.05图3 叶用甜菜不同取材时间分裂相细胞和中期分裂相细胞的百分比Fig.3 The percentage of cells at the mitotic and metaphase stage in leaf beet under different sampling time points

2.2 核型分析

选择30个染色体分散良好的细胞进行观察计数，结果表明，所有细胞的染色体均为18条，占计数细胞的100%，所以叶用甜菜的染色体数目为2n=2x=18。图4显示叶用甜菜各染色体清晰可见，均呈X型，且着丝粒明显，其中，2条染色体具有随体。核型分析的结果见表1，叶用甜菜染色体相对长度变化范围为8.75%～13.29%；染色体相对长度系数变化范围为0.79～1.20，其染色体相对长度组成为8M2+10M1；着丝粒指数变化范围为36.67%～47.04%，臂比值变化范围为1.13～1.73，其中，第2对染色体为近中部着丝粒染色体(sm)，其余8对为中部着丝粒染色体(m)，随体位于第2对染色体上。核型公式为2n=2x=18=16m+2sm(2SAT)，染色体长度比为1.52，没有臂比值大于2∶1的染色体，根据Stebbins的核型分类标准，叶用甜菜的核型属1A型，核型不对称系数为58.50%。其核型模式图如图5所示。

数字1—9为染色体编号The numbers 1-9 represent chromosome No.图4 叶用甜菜根尖染色体中期分裂相与核型图(×1 000)Fig.4 Metaphase chromosomes and karyotype of leaf beet root tips (×1 000)

表1 叶用甜菜染色体核型参数

Table 1 Karyotype parameters of leaf beet chromosomes

染色体编号ChromosomeNo.相对长度Relativelength/%短臂Shortarm长臂Longarm全长Totallength相对长度系数Indexofrelativelength着丝粒指数Centromereindex/%臂比值Armra-tio类型Type15.347.9513.291.2040.191.49m2*4.577.8912.461.1236.671.73sm35.456.8012.241.1044.491.25m45.576.2711.841.0747.041.13m54.746.2611.000.9943.091.32m64.046.2510.290.9339.281.55m74.235.9610.190.9241.511.41m83.916.029.930.8939.401.54m93.655.108.750.7941.701.40m

*表示染色体带有随体，随体长度未计算在内；m，中部着丝粒染色体；sm，近中部着丝粒染色体。

* means the chromosomes with satellites， and the length of satellites is not included in the chromosome length. m means the metacentric chromosome， and sm means the submetacentric chromosome.

图5 叶用甜菜染色体核型模式图Fig.5 Chromosome idiogram of leaf beet

3 讨论

很多蔬菜的染色体属小染色体型，且相邻染色体形态又非常相似[10-11]，因此，本试验首先针对解离时间、预处理时间和取材时间等因素进行了条件优化，确定了叶用甜菜的最佳染色体制片条件。解离是影响染色体制片效果的一项重要因素，其主要目的是软化和分解部分细胞壁，同时清除部分细胞质，使细胞质背景透明化，便于染色体的观察。本试验发现，解离时间过短，解离不够充分，根尖外部的细胞染色体和细胞质均着色较深，对比度低，而内部的细胞由于接触不到染液而较难着色，压片时细胞不易分散，细胞染色体和细胞质着色对比度低，不易观察；解离时间过长，染色体和细胞质均不易着色，这也与前人的研究结果基本一致[12-13]。预处理是植物染色体制片过程中的关键环节，它的主要作用是获得更多的中期分裂相细胞，同时改变细胞质的黏度，促使染色体收缩与分散。预处理对制片效果的影响主要表现在处理试剂和处理时间两方面[14]。本试验中选取的试剂是0.002 mol·L-18-羟基喹啉溶液，8-羟基喹啉处理能使染色体、缢痕和次缢痕清晰，显示效果良好[13]。不同蔬菜品种的预处理时间也存在明显差异，如青花菜、芥蓝等甘蓝类蔬菜的最优预处理为8-羟基喹啉处理2.0～2.5 h[10-11，15]，而本试验结果表明，叶用甜菜预处理9 h效果最佳。此外，取材时间能够显著影响分裂相细胞，特别是中期分裂相细胞的比例，一般植物分裂期的高峰多出现在上午，取材时间也多设在上午，以获得更多的分裂相[13，16-18]，如百里香在上午9：00取材最佳[13]，黄瓜在上午8：40—9：10取材最佳[16]。恒温条件下，根尖长度不同会导致分裂相比例不同，如25 ℃恒温暗培养条件下青花菜根尖长度13～15 mm时分裂相最多。本试验中采用25 ℃/18 ℃变温培养条件，样品选取时兼顾根尖长度因素，将根尖长度范围限制在10～15 mm，最终结果表明，叶用甜菜的最佳取材时间为上午9：00，与黄瓜和百里香等植物的最佳取材时间基本相同。

陈瑞阳等[6]报道了甜菜属3种糖用甜菜的核型结果，本试验将叶用甜菜与糖用甜菜的核型差异进行了比较(表2)。结果表明，叶用甜菜与糖用甜菜在核型公式、核型分类、随体、臂比值、着丝粒指数范围和核型不对称系数等多个方面存在明显差异，这些差异可能与倍性及种间差异有关。首先，这3种报道的糖用甜菜，其倍性分别为2倍体、3倍体和4倍体，且随着倍性的增加，其臂比值范围、着丝粒指数范围和相对长度范围等范围逐渐扩大，平均臂比值、臂指数、核型不对称系数等也逐渐增加。同时，2倍体糖用甜菜与3倍体和4倍体间也存在较大差异，如2倍体中仅有中部着丝粒染色体(m)，而3倍体和4倍体中均出现了近中部着丝粒染色体(sm)；核型分类也随倍性增加呈现从1A、2A和2B的从原始向进化过渡的趋势[19]；2倍体中未见随体出现，3倍体和4倍体中均有，且都出现在4号染色体上；2倍体中未见臂比>2的染色体，3倍体和4倍体中均有1/9的染色体臂比>2。本试验中，叶用甜菜染色体数目18条，为2倍体。通常同一种的随体数量和位置是相对稳定的，但同一种的不同变种、不同类型及不同品种间其随体的数目、位置和形态等可能存在不同程度的变异[5，10]。与2倍体糖用甜菜不同，本试验中的叶用甜菜存在1对随体，且随体出现在2号染色体上，这也与3倍体和4倍体糖用甜菜随体位置不同。同时，叶用甜菜中也出现了sm型染色体，这也是2倍体糖用甜菜中未见到的，而叶用甜菜平均臂比值和核型不对称系数也明显高于3种糖用甜菜，但核型分类、臂指数、相对长度范围和着丝粒指数范围在叶用甜菜和2倍体糖用甜菜间相同或相似。综上可知，糖用甜菜随倍性的增加，逐渐从原始向进化过渡，而叶用甜菜的核型结果表明，叶用甜菜较2倍体糖用甜菜进化水平更高。

表2 叶用甜菜与已报道的糖用甜菜[6]核型差异比较

Table 2 The differences of chromosome karyotype between leaf beet and reported sugar beet

项目Index叶用甜菜Leafbeet糖用甜菜aSugarbeeta糖用甜菜bSugarbeetb糖用甜菜cSugarbeetc染色体数目Chromosomenumbers2n=2x=182n=2x=182n=3x=272n=4x=36核型公式Karyotypeformula16m+2sm(2SAT)18m(2SAT)24m(3SAT)+3sm28m(4SAT)+8sm核型分类Karyotypetype1A1A2A2B随体个数Satellitenumbers2034随体所在染色体序号Satellitesposition2—44相对长度范围Rangeofrelativelength/%8.75～13.297.96～13.048.52～13.187.37～15.38臂比值范围Rangeofarmratio1.13～1.731.09～1.641.06～2.261.08～2.35平均臂比值Averagearmratio1.421.241.391.46臂比>2的染色体比例Chromosomeratioofarmratio>2000.110.11臂指数Armindex36365472着丝粒指数范围Rangeofcentromericindex36.67～47.0438.15～47.8030.82～48.4629.97～49.17核型不对称系数As.K/%58.5054.8957.3158.02

“—”表示没有随体。

“—” indicated no satellite in chromosomes.

本试验对绿梗叶用甜菜的染色体制片条件进行了优化，1 mol·L-1HCl 60 ℃解离最佳时间为12 min，0.002 mol·L-18-羟基喹啉预处理最佳时间为9 h，取材最佳时间为上午9：00，条件优化结果为叶用甜菜的核型分析、原位杂交及分子标记等研究提供了基础。本试验还揭示了叶用甜菜的核型特征，并与已报道的糖用甜菜核型进行比较，丰富了人们对叶用甜菜遗传组成的认知，为其分类地位、种的进化、种内亲缘关系、遗传多样性研究及育种工作提供了参考。

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(责任编辑 侯春晓)

Optimization of chromosome preparation and karyotype analysis of leaf beet

SUN Bo， TIAN Yu-xiao， XIA Xue， LI Meng-jiao， LUO Ling-ling， LI Lin， CHEN Qing， ZHANG Fen， TANG Hao-ru*

(CollegeofHorticulture，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

In the present study， the green-stalk leaf beet cultivar was used as plant material， chromosome staining factors including dissociation duration， pretreatment and sampling time point were optimized， and karyotype characteristics were also investigated. The results showed that the best chromosome staining and cytoplasm transparency as well as the highest contrast were observed at 12 min dissociation; The best contraction， shape and dispersion of chromosomes were found at 9 h pretreatment with 0.002 mol·L-18-hydroxyquinoline; The percentage of the mitotic cells and metaphase cells reached maximum when sampled at 9：00 A.M.. Leaf beet had a total of 18 chromosomes. The karyotype formula was 2n=2x=18=16m+2sm (2SAT)， the ratio of chromosome length (L/S) was 1.52， and the constitution of the relative length was 8M2+10M1. The relative lengths ranged from 8.75% to 13.29%， the centromeric index ranged from 36.67% to 47.04%， and arm ratio ranked from 1.13 to 1.73. Moreover， the second pair of chromosomes， which own two satellites (SAT)， was submetacentric chromosomes (sm)， while other eight pairs of them were metacentric chromosomes (m). Karyotype asymmetry index (As.K) was 58.50%， and karyotype characteristics fell into type 1A according to Stebbins classification criteria. Meanwhile， the obtained results were compared with those from the already reported sugar beet so as to reveal the karyotype differences between the two， and the significant differences were found on karyotype formula， karyotype characteristics， satellites and As.K. In conclusion， the results revealed the karyotype characteristic of leaf beet， and provided a theoretical basis for karyotype comparison among different types of leaf beet.

leaf beet; chromosome; preparation optimization; karyotype analysis

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.10.11

2016-01-22

四川省教育厅重点项目(14ZA0016)；四川省省级大学生创新训练计划项目(201510626060)；四川农业大学本科质量工程项目(04051946)；四川农业大学本科论文培育计划项目(06309007)；四川农业大学本科教学改革研究项目(X2015020)

孙勃(1983—)，男，山西孝义人，博士，副教授，研究方向为蔬菜遗传育种。E-mail: 14099@sicau.edu.cn

*通信作者，汤浩茹，E-mail: htang@sicau.edu.cn

S636

A

1004-1524(2016)10-1704-07

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(10): 1704-1710

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