肿瘤相关巨噬细胞和KIT评估胰腺神经内分泌肿瘤肝转移及预后的价值

叶良涛 周泉波 叶会霖 郑上游 陈汝福



·论著·

肿瘤相关巨噬细胞和KIT评估胰腺神经内分泌肿瘤肝转移及预后的价值

叶良涛 周泉波 叶会霖 郑上游 陈汝福

目的 探讨肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)结合3型酪氨酸激酶受体(KIT)对胰腺神经内分泌肿瘤(PNETs)肝转移风险及预后的评估价值。 方法 收集1995年1月至2015年5月间中山大学孙逸仙纪念医院行手术治疗并经病理诊断证实的79例PNETs患者资料。采用免疫组化染色法检测肿瘤组织CD68、KIT蛋白表达，分析其与肿瘤临床病理参数的相关性。结果 79例PNETs中30例(38.0%)瘤组织CD68高表达，35例(44.3%)瘤组织KIT高表达。CD68高表达与肿瘤侵犯(P<0.001)、AJCC7th分期(P<0.001)、肝转移(P<0.001)及其发生时间有关(P=0.019)；CD68低表达患者的生存期显著长于高表达患者，差异有统计学意义(P=0.0002)。KIT高表达与WHO 2010及AJCC7th分期(P<0.001，P=0.002)、肿瘤无功能性(P=0.002)、肝转移有关(P=0.026)；KIT低表达患者的生存期显著长于高表达患者，差异有统计学意义(P=0.0013)。CD68、KIT均高表达患者常见于肿瘤侵犯者(P<0.001)，与WHO 2010、AJCC7th分期有关(P值均<0.001)；CD68、KIT均高表达患者的生存期显著短于均低表达者，差异有统计学意义(P=0.0057)。多因素分析显示AJCC7th分期Ⅳ期、CD68高表达是PNETs患者预后的独立危险因素。结论 CD68、KIT高表达与PNETs分级分期、肝转移风险、不良预后相关，CD68是预测PNETs预后的独立危险因素。

胰腺神经内分泌肿瘤； 巨噬细胞； KIT； 预后； 肿瘤转移

Fund Program: National Scientific Foundation of China(81370059)

胰腺神经内分泌肿瘤(pancreatic neuroendocrine tumors，PNETs)是一种罕见的、异质性肿瘤，占胰腺肿瘤的1.3%～10%，年发病率近年来逐步上升(0.94/10万人)[1-3]。PNETs生物学行为复杂，临床表现、治疗及预后个体差异显著，给临床工作带来巨大的挑战[2,4]。传统的内分泌瘤评价指标CgA、Syn、Ki-67、核分裂数等未能从分子机制的层面深入剖析PNETs，目前临床上仍缺乏较为深入、客观的预后评价指标[5]。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)是外周血单核细胞在肿瘤相关趋化因子的作用下迁移至肿瘤微环境中增殖、分化形成的[6]。研究表明，TAMs与PNETs的肿瘤进展、分期、术后肝转移风险密切相关[1,5]。TAMs基本都表达CD68，因此普遍应用CD68作为检测TAMs的标记物。近年来酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinases, RTKs)在肿瘤的发生和发展中发挥重要的调控作用。KIT原癌基因即3型RTKs，作为RTKs阻断治疗的分子靶点受到广泛关注[7-8]。KIT突变与PNETs的发生、侵袭、复发转移等事件联系密切[4,8-9]。本研究旨在探讨CD68、KIT作为PNETs的潜在生物标记，能否进一步优化PNETs预后的判断标准，筛选出具有不良预后倾向的病例，以指导临床诊治与术后随访。

资料与方法

一、研究对象

收集1995年1月至2015年5月间广州中山大学孙逸仙纪念医院行手术治疗且经病理证实的79例PNETs患者，临床资料、随访及联系方式齐全。诊断、分类、分期均符合2010年第4版WHO胰腺神经内分泌肿瘤的分类及命名标准[10](以下简称WHO 2010分期)、2011年中国胃肠胰神经内分泌肿瘤病理学诊断共识[11]、2010年AJCC第7版TNM分期标准[12](以下简称AJCC7th分期)、2014年胰腺神经内分泌肿瘤诊治专家共识[13]。本研究为回顾性队列分析，并通过孙逸仙纪念医院伦理委员会审查通过。

二、免疫组化染色

取孙逸仙纪念医院病理科保存的标本，切片后采用免疫组化染色Envision二步法检测胰腺CD68、KIT表达。抗CD68抗体购自美国Dako公司。工作浓度1∶100；抗KIT抗体购自丹麦Dako Cytomation公司，工作浓度1∶200。胰腺组织嗜铬粒蛋白A (chromogranin A, CgA)、突触素(synaptophysin, Syn)、Ki-67表达的染色结果及相关数据均来源于病理科出具的病理报告。胞质或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性表达。阳性细胞占总细胞数10%以下为低表达，以“-”表示，≥10%为高表达，以“+”表示。

三、随访情况

术后采用电话、门诊复查的方式随访，截止时间为2015年5月31日。总生存期(overall survival，OS)指从住院到死亡或最后随访的时间。52例患者获得有效随访，随访率为65.8%。

四、统计学处理

结果

一、临床病理特征

79例PNETs患者中男性32例，女性47例，平均年龄56岁。肿瘤类型：胰岛素瘤30例(38.0%)，无功能性肿瘤23例(29.1%)，内分泌癌16例(20.3%)，类癌3例(3.7%)，胰高血糖素瘤2例(2.5%)，胃泌素瘤2例(2.5%)，血管活性肠肽瘤1例(1.3%)，副神经节瘤1例(1.3%)，神经节瘤1例(1.3%)。肿瘤平均大小为3.02 cm。WHO 2010分期为G1期42例(53.2%)，G2期27例(34.2%)，G3期10例(12.6%)；AJCC7th分期为Ⅰ期35例(44.3%)，Ⅱ期25例(31.6%)，Ⅲ期9(11.4%)，Ⅳ期10例(12.7%)。同期肝转移1例(1.3%)，术后肝转移14例(17.7%)。手术方式：胰体尾切除术±脾切除术22例(27.8%)，胰十二指肠切除术19例(24.1%)，肿瘤剜除术16例(20.3%)，EUS-FNA术6例(7.6%)，保留幽门的胰十二指肠切除术6例(7.6%)，腹腔镜胰十二指肠切除术5例(6.3%)，胰腺中段切除术2例(2.5%)，姑息性手术2例(2.5%)，内镜下活检术1例(1.3%)。

二、胰腺组织CD68、KIT表达

慢性胰腺炎组织中CD68弱阳性表达，KIT几乎不表达；PNETs组织中CD68及KIT均阳性表达，且随分期进展，阳性染色范围及强度依次逐渐增强(图1)。38.0%(30/79)PNETs患者CD68高表达，44.3%(35/79)KIT高表达。

图1 慢性胰腺炎及PNETs G1、G2、G3期肿瘤组织CD68(1A、1B、1C、1D)、KIT(1E、1F、1G、1H)表达 (免疫组化 ×10)

三、CD68、KIT表达与临床病理参数的相关性

CD68高表达与肿瘤远处转移、AJCC7th分期密切相关；KIT高表达与WHO 2010、AJCC7th分期密切相关，更常见于无功能性PNETs(表1)。

将79例PNETs根据低表达(-)、高表达(+)重新分组，CD68-/KIT-组26例(32.9%)、CD68-/KIT+组23例(29.1%)、CD68+/KIT-组18例(22.8%)、CD68+/KIT+组12例(15.2%)。CD68+/KIT+更常见于邻近器官侵犯、远处转移者(P<0.001)，且与WHO 2010、AJCC7th分期密切相关(P值均<0.001，表2)。

表1 PNETs中CD68、KIT表达与肿瘤临床病理参数的关系

临床参数CD68表达-+P值KIT表达-+P值平均年龄(岁)54．156．50．335a55．757．20．742a性别(例) 女性31160．383b29180．193b 男性18141517肿瘤部位(例) 钩突或胰头21190．077b20200．302b 胰体尾28112415肿瘤侵犯范围(例) 局限性455<0．001c29210．527c 侵犯邻近器官4181210 远处转移0734WHO2010分期(例) G13570．469c366<0．001c G21017621 G34628AJCC7th分期(例) Ⅰ323<0．001c2690．002c Ⅱ11141213 Ⅲ2736 Ⅳ4637功能性肿瘤(例) 是27130．310b29110．002b 否22171524神经浸润(例) 阴性28140．365b26160．237b 阳性21161819

注：-为低表达，+为高表达；a：Spearman秩相关检验；b：Pearson χ2检验；c：多组独立样本的秩和检验

表2 CD68、KIT双表达与肿瘤临床病理参数的关系

注：-为低表达；+为高表达； a：Spearman秩相关检验；b：Pearson χ2检验；c：多组独立样本的秩和检验

四、CD68、KIT与肝转移及其发生时间的相关性

15例(19.0%)发生肝转移者中13例(86.7%)CD68高表达，2例(13.3%)低表达；64例(81.0%)无肝转移者中17例(26.6%)CD68高表达，47例(73.4%)低表达。15例肝转移患者中11例(73.3%)KIT高表达，4例(26.7%)低表达；64例无肝转移患者中24例(37.5%)KIT高表达，40例(62.5%)低表达。CD68、KIT高表达患者发生肝转移例数显著高于低表达者，差异均有统计学意义(χ2=16.173，P<0.001；χ2=4.955，P=0.026)。CD68高表达患者发生肝转移的时间为(0.98±1.36)年，显著短于低表达患者的(2.76±0.47)年，差异有统计学意义(t=3.552，P=0.019)。KIT高表达患者发生肝转移的时间为(0.85±1.37)年，短于低表达患者的(2.21±1.09)年，但差异无统计学意义(t=1.997，P=0.087)。

五、影响PNETs患者生存期的单因素及多因素分析

单因素分析显示肿瘤范围、WHO 2010分期、AJCC7th分期及CD68、KIT、Ki-67高表达均与PNETs患者生存期有关。多因素分析显示AJCC7th分期Ⅳ期、CD68高表达、Ki-67阳性指数>20是本组患者影响预后的独立危险因素(表3)。

表3 79例PNETs患者生存期的单、多因素分析

注：年龄、性别、肿瘤部位未纳入多因素分析

六、CD68、KIT表达与患者生存期的关系

PNETs患者的Kaplan-Meier生存曲线见图2。CD68、KIT低表达患者生存期长于高表达者，差异均有统计学意义(P值分别为0.0002、0.0013)，CD68-/KIT-患者的生存期长于单高表达或双高表达患者，差异有统计学意义(P值分别为0.0004、0.0057)。

图2 CD68高低表达(2A)、KIT高低表达(2B)及不同高低表达组合(2C、2D)患者的生存曲线

PNETs为少见且具有恶性潜能的肿瘤[13-14]，但在过去的10～40年间，世界范围内新发的PNETs以1.5～3倍的速度增长[14]。这与目前诊断技术的进步、医师对此类疾病认知的深入有关，也与肿瘤本身发病率的增加有关。学术界认为，肿瘤并非仅由肿瘤细胞组成，而是包括成纤维、免疫、炎性、胶质等多种细胞在内的异质性混合体，亦包括附近区域的细胞间质、微血管与生物分子[6]，肿瘤微环境也调控肿瘤细胞的生物学行为。TAMs作为主要的免疫细胞，在胰腺肿瘤的发生演进中发挥重要作用。Pyonteck等[5]报道，27例PNETs内高度TAMs浸润与肿瘤的分级分期、远处转移相关。Wei等[1]报道，97例无功能性PNETs的TAMs浸润与术后复发密切相关。

CD68是重要的预测复发转移的指标，可有效评估肿瘤复发的风险。本研究结果显示，CD68高表达与WHO、AJCC分期密切相关，能提示肝转移的风险及肝转移发生时间。也是影响患者预后的独立危险因素。

KIT是表达于胞膜的酪氨酸激酶受体，其突变与小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌等的不良预后密切相关[2,8]。在胚胎发育时期，KIT表达于胰腺组织，参与胰腺β细胞的发育与糖代谢调控[2,15]。文献报道，KIT在胰腺导管腺癌、PNETs中表达，PNETs的KIT高表达率为8.8%～46.0%[4,8]。本研究结果显示，PNETs的KIT高表达率为44.3%，与PNETs的分期、肝转移风险、无功能状态密切相关，与Son等[2]、Knoesel等[4]、Zhang等[9]的报道一致。

CD68、KIT均高表达患者更常见于邻近器官侵犯、远处转移者，且与WHO 2010、AJCC7th分期密切相关。

PNETs患者缺乏特异性症状，在就诊时或术后极易发生远处转移，尤其是肝转移。本研究结果显示，本组15例患者发生肝转移，这些患者大多数高表达CD68、KIT，且肝转移时间集中发生在术后10～12个月，因此建议术后以2～3个月的频率密切随访患者，至少1年以上[1]。

[1] Wei IH, Harmon CM, Arcerito M, et al. Tumor-associated macrophages are a useful biomarker to predict recurrence after surgical resection of nonfunctional pancreatic neuroendocrine tumors[J]. Ann Surg, 2014, 260(6):1088-1094. DOI: 10.1097/SLA.0000000000000262.

[2] Son EM, Kim JY, An S, et al. Clinical and prognostic significances of cytokeratin 19 and KIT expression in surgically resectable pancreatic neuroendocrine tumors[J]. J Pathol Transl Med, 2015,49(1):30-36. DOI: 10.4132/jptm.2014.10.23.

[3] Sandvik OM, Soreide K, Gudlaugsson E, et al. Epidemiology and classification of gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasms using current coding criteria[J]. Br J Surg, 2016,103(3):226-232. DOI: 10.1002/bjs.10034.

[4] Knosel T, Chen Y, Altendorf-Hofmann A, et al. High KIT and PDGFRA are associated with shorter patients survival in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors, but mutations are a rare event[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2012,138(3):397-403. DOI: 10.1007/s00432-011-1107-9.

[5] Pyonteck SM, Gadea BB, Wang HW, et al. Deficiency of the macrophage growth factor CSF-1 disrupts pancreatic neuroendocrine tumor development[J]. Oncogene, 2012,31(11):1459-1467. DOI: 10.1038/onc.2011.337.

[6] 叶会霖, 叶良涛, 周雨, 等. 肿瘤相关巨噬细胞通过PI3K/Akt途径促进胰腺癌浸润迁移的研究[J]. 中华普通外科学文献(电子版), 2015,3:009. DOI: 10.3877/cma.j.issn.1674-0793.2015.03.006.

[7] Perkins J, Boland P, Cohen SJ, et al. Successful imatinib therapy for neuroendocrine carcinoma with activating Kit mutation: a case study[J]. J Natl Compr Cancer Netw, 2014,12(6):847-852.

[8] Han X, Zhao J, Ji Y, et al. Expression of CK19 and KIT in resectable pancreatic neuroendocrine tumors[J]. Tumour Biol, 2013,34(5):2881-2889. DOI: 10.1007/s13277-013-0850-8.

[9] Zhang L, Smyrk TC, Oliveira AM, et al. KIT is an independent prognostic marker for pancreatic endocrine tumors: a finding derived from analysis of islet cell differentiation markers[J]. Am J Surg Pathol, 2009,33(10):1562-1569. DOI: 10.1097/PAS.0b013e3181ac675b.

[10] Rindi G, Petrone G, Inzani F. The 2010 WHO classification of digestive neuroendocrine neoplasms: a critical appraisal four years after its introduction[J]. Endocr Pathol, 2014,25(2):186-192. DOI: 10.1007/s12022-014-9313-z.

[11] 朱雄增, 郑杰. 中国胃肠胰神经内分泌肿瘤病理学诊断共识[J]. 中华病理学杂志, 2011,40(4):257-62. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0529-5807.2011.04.010.

[12] Edge SB, Compton CC. The American joint committee on cancer: the 7th edition of the AJCC cancer staging manual and the future of TNM[J]. Ann Surg Oncol, 2010,17(6):1471-1474. DOI: 10.1245/s10434-010-0985-4.

[13] 王成峰. 胰腺神经内分泌肿瘤诊治专家共识[J]. 中华肿瘤杂志, 2014,36(009):717-720. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2014.09.017.

[14] Fraenkel M, Faggiano A, Valk GD. Epidemiology of Neuroendocrine Tumors[J]. Front Horm Res, 2015,44:1-23. DOI: 10.1159/000381970.

[15] Yasuda A, Sawai H, Takahashi H, et al. The stem cell factor/c-kit receptor pathway enhances proliferation and invasion of pancreatic cancer cells[J]. Mole Cancer, 2006,5:46. DOI: 10.1186/1476-4598-5-46.

(本文编辑：吕芳萍)

Tumor-associated macrophages and KIT predict liver metastasis of pancreatic neuroendocrine tumors and prognosis

YeLiangtao,ZhouQuanbo,YeHuilin,ZhengShangyou,ChenRufu.

DepartmentofHepatopancreatobiliarySurgery,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,ChinaCorrespondingauthor:ChenRufu,Email:RufuChen63@yahoo.com

Objective To investigate the assessed value of tumor-associated macrophages (TAMs) and KIT expression for liver metastasis in pancreatic neuroendocrine tumors (PNETs) and patients′ outcome. Methods A total of 79 patients who underwent surgical resection and pathologically diagnosed as PNETs in the Department of Hepatopancreatobiliary Surgery in Sun Yat-sen Memorial Hospital from January 1995 to May 2015 were enrolled. The immunohistochemical staining of CD68and KIT were detected and the correlations with clinicopathological factors were analyzed. Results Of 79 PNETs cases, CD68and KIT in tumor tissue were overexpressed in 30(38%) and 35(44.3%) cases, respectively. CD68overexpression was associated with tumor infiltration (P<0.001), AJCC stage 7(P< 0.001), liver metastasis (P<0.001) and early recurrence (P=0.019). Patients with low CD68level had significantly better survival than those with high CD68expression (P=0.0002). KIT overexpression was correlated with WHO 2010 and AJCC stage 7 (P<0.001;P=0.002), nonfunctional status of the tumor (P=0.002) and liver metastasis (P=0.026). The survival period of patients with low KIT expression was greatly longer than those with high KIT level (P=0.0013). CD68and KIT co-overexpression was observed in patients with tumor invasion (P<0.001),

Pancreatic neuroendocrine tumors; Macrophages; KIT; Prognosis; Neoplasm metastasis

国家自然科学基金(81370059)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.05.006

510120 广州，中山大学孙逸仙纪念医院胆胰外科

陈汝福，Email: RufuChen63@yahoo.com

advanced WHO and AJCC stage (bothP<0.001) and better prognostic survival (P=0.0057). Multivariate analysis showed that CD68overexpression (HR: 2.9; 95%CI: 1.16～7.23;P=0.033) was an independent prognostic factor for PNETs. Conclusions CD68and KIT overexpression is correlated with advanced disease stage, higher risk for liver metastasis and worse survival. CD68is an independent prognostic factor for PNETs.

2016-01-25)