固本补肾口服液的总黄酮含量测定方法研究

韦瑀龙，黄小鸥，蓝晓庆



固本补肾口服液的总黄酮含量测定方法研究

韦瑀龙1，黄小鸥1，蓝晓庆2

目的 建立固本补肾口服液总黄酮的含量测定方法。方法 比较HCl-Mg法、AlCl3法、NaNO2-AlNO3-NaOH法3种不同显色方法，以及槲皮素、淫羊藿苷、芦丁3种对照品的波长扫描图谱，确定测定条件。结果 以NaNO2-AlNO3-NaOH法显色，芦丁为对照品，508 nm波长条件下测定，芦丁在0.105 5～1.107 5 mg/mL间线性关系良好(R2=1.000 0)，样品平均回收率98.83% (RSD=1.17%)。结论 NaNO2-AlNO3-NaOH法显色适用于固本补肾口服液总黄酮含量的初步测定。

固本补肾口服液；总黄酮；NaNO2-AlNO3-NaOH显色

0 引言

固本补肾口服液由黄芪、淫羊藿、枸杞、桑寄生、麦冬、牛膝、菟丝子、杜仲、黄精组方而成，具有固本培元、补肾生精等功效，主要用于肾虚阳痿、早泄、精液异常，为广西名老中医荀建宁教授临床验方，其主要药味黄芪、淫羊藿、桑寄生的主要化学成分之一均为黄酮。本文拟通过研究固本补肾口服液中总黄酮的含量测定方法，为建立其质量控制方法奠定基础。近年来金属离子络合法已成为测定总黄酮含量应用最广泛的方法，其原理是在一定条件下，金属离子与黄酮发生络合反应，形成有颜色的螯合物，用比色法测定总黄酮的含量，其最常用的显色方法有HCl-Mg法、AlCl3法、NaNO2-AlNO3-NaOH法，本文通过对这3种方法条件下槲皮素、淫羊藿苷、芦丁3种对照品的考察，建立适用于本品的总黄酮含量测定方法。

1 仪器与试药

CQ-250超声波清洗机(上海跃进医用光学器械厂)，53WBI微机型紫外-可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)，电子分析天平(GR-202，日本)，槲皮素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100081-200907)，淫羊藿苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：0737-9910)，芦丁对照品(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-15091104，供UV测定用)，固本补肾口服液(广西中医药大学附属瑞康医院制剂室，20 mL/支，批号：20151222、20151226、20151228)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 精密吸取本品4.0 mL，置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再精密吸取稀释液1.0 mL置10 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品42.1 mg，置100 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.421 mg/mL的对照品溶液。

2.3 测定法 精密吸取供试品溶液2.0 mL置25 mL 量瓶中，加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以未加入硝酸铝显色的上述样品液为参比空白，立即在508 nm波长下测定吸光度(芦丁对照品的测定以相应的试剂为空白)。

2.4 显色方法及对照品考察

2.4.1 HCl-Mg法[1]精密吸取芦丁、淫羊藿苷(0.420 mg/mL)、槲皮素(0.440 mg/mL)对照品溶液及供试品溶液各1.0 mL，分别置于加有镁粉300 mg的试管中，将试管置冷水浴(约15 ℃)中，缓慢滴加浓盐酸3 mL并不时振摇试管，加70%乙醇补足至10 mL，摇匀，置沸水浴中加热约15 min，取出，迅速冷却至室温，以相应试剂为空白，于400～700 nm 进行波长扫描。结果芦丁、淫羊藿苷与供试品在此波长段有相近的吸收峰值。但多次预试验结果表明，该反应过程剧烈，反应液中含有的乙醇更使反应结果的重复性难以控制。同时，该法对多数异黄酮类成分不显色[2]，这与本品的主要药味-黄芪主要含异黄酮类成分不相符[3]，故不宜采用此法作为本品总黄酮的测定方法。

2.4.2 AlCl3法[4]取“2.4.1”项下的供试品溶液、对照品溶液各1.0 mL，分别置于20 ℃水浴锅中放置的10 mL量瓶中，加入0.1 mol/L AlCl3溶液3 mL，然后加入1 mol/L NaAc溶液4 mL，反应2 min后取出，用70%乙醇定容，待溶液温度降至室温，供试品以未加AlCl3溶液的上述供试品测定液作为空白，对照品以相应的试剂为空白，在400～700 nm 扫描。结果芦丁与槲皮素在417 nm有最大吸收，而供试品在此波长段无吸收峰。

2.4.3 NaNO2-AlNO3-NaOH法[5]取“2.4.1”项下的供试品溶液、对照品溶液各2.0 mL置25 mL量瓶中，加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，供试品以未加AlCl3溶液的上述供试品测定液作为空白，对照品以相应的试剂为空白，立即在400～700 nm扫描。结果供试品与芦丁在500 nm左右皆有吸收峰，且峰形对称(见图1)，而槲皮素、淫羊藿苷在此波长段无吸收峰。芦丁吸收峰值508 nm，供试品吸收峰值495 nm，故选择以芦丁为对照品在508 nm处测定供试品吸光度。

图1 NaNO2-AlNO3-NaOH显色波长扫描图谱

2.5 方法学考察

2.5.1 线性范围考察 精密吸取芦丁对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，分别置25 mL量瓶中，照“2.3”项下的方法，自“加水至6 mL”起依法操作，测定吸光度，以吸光度(A)为纵坐标，浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=0.881 28X-0.000 01，R2=1.000 0，表明芦丁在0.105 5～1.107 5 mg/mL线性关系良好。

2.5.2 重复性试验 按“2.3”项下方法平行制备6份供试品测定液，测定吸光度，结果总黄酮含量RSD=1.36%，表明本方法重复性良好。

2.5.3 精密度试验 取同一供试品测定液连续测定6次，结果RSD=0.46%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 取同一供试品测定液于0、5、10、15 min测定吸光度，结果RSD=2.07%，表明供试液在15 min内稳定性良好。

2.5.5 加样回收率试验 精密吸取已知总黄酮含量(7.290 mg/mL)的样品溶液4.0 mL，置10 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密吸取稀释液0.5 mL置10 mL量瓶中，再精密加入芦丁对照品1.684 mg，照“2.3”项下的方法，自“加水至6 mL”起依法操作，以上述未加硝酸铝溶液的试液为参比空白测定吸光度，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.6 样品测定 取3批固本补肾口服液，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，并按“2.3”项下方法依法显色、测定总黄酮含量。结果见表2。

3 讨论

NaNO2-AlNO3-NaOH法显色原理：亚硝酸钠还原被氧化的酚羟基，使其能与铝离子络合，并提供一个碱性环境(酸性环境中铝离子不与邻二酚羟基络合)，络合之后，产生一个稳定的特征吸收峰，再加入氢氧化钠使酚羟基解离，形成p-π共轭，使吸收峰红移至可见光区，避免杂质干扰(杂质不红移)。邻二酚羟基是该反应的关键功能基团，而且邻二酚羟基的邻位无取代基也是必需条件之一[6]。

供试品溶液NaNO2-AlNO3-NaOH显色后，稳定性较差，显色后室温下放置5、10、15 min后，吸光度分别降低0%、2.0%、4.3%，15 min时RSD>2%，因此，显色后应尽快测定样品。这与《中国药典》中采用该法测定总黄酮时，要求显色完成后“立即照紫外-可见分光光度法测定”相符，而与部分文献报道的数据不一致[7-8]。

表2 三批样品测定结果

中药供试品往往因成分复杂，不经显色处理在测定波长下也有一定的吸光度，依据本法的显色原理，文中采用未加络合离子(AlNO3)的供试品溶液作为供试品测定液的空白，以消除本底及其他成分对亚硝酸钠、氢氧化钠显色的影响。

[1] 党晓芳,曹飒,祁娟娟,等.鬼箭羽总黄酮含量测定方法的建立[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(9):96-98.

[2] 匡海学.中药化学[M].北京:中国中医药出版社,2011.

[3] 李春红,田吉,何兵,等.紫外分光光度法测定黄芪总黄酮的含量[J].重庆医科大学学报,2011,36(8):954-956.

[4] 张明,陈华国,赵超,等.杠板归中总黄酮的含量测定[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(18):77-80.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社,2015.

[6] 郭亚健,范莉,王晓强,等.关于NaNO2-AlNO3-NaOH比色法测定总黄酮方法的探讨[J].药物分析杂志,2002,22(2):97-99.

[7] 李春红,田吉,何兵,等.紫外分光光度法测定黄芪总黄酮的含量[J].重庆医科大学学报,2011,36(8):954-965.

[8] 常飞,吴文能,曹晖.白补药总黄酮含量测定该法的建立[J].天然产物研究与开发,2016,28(82):71-76.

Optimization of determination for total flavonoids in Guben bushen oral liquid

WEI Yu-long1,HUANG Xiao-ou1,LAN Xiao-qing2

(1.Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530001,China;2.Guangxi Jia Ye Technology Co.Ltd,Nanning 530001,China)

Objective To establish a method for the determination of the content of total flavonoids in Guben bushen oral liquid.Methods Both three coloration methods and three

ubstances were studied to find the ideal coloration method and determination conditions.Results The sample was detected at 508 nm wavelength by NaNO2-AlNO3-NaOH reaction with Botanic as reference substance.Botanic had a liner relationship with absorbance in the range of 0.105 5～1.107 5 mg/mL(R2=1.000 0),and the average recovery rate was 98.83% withRSDof 1.17%.Conclusion The NaNO2-AlNO3-NaOH coloration method is applicable for the determination of total flavonoids in Guben bushen oral liquid.

Guben bushen oral liquid;Total flavonoids;NaNO2-AlNO3-NaOH coloration method

2016-03-08

1.广西中医药大学附属瑞康医院，南宁 530001；2.广西佳业科技有限公司，南宁 530001

广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项(GZZJ13-11)

10.14053/j.cnki.ppcr.201610020