骨痨敌注射液HPLC指纹图谱研究

刘虹霞，张译丹，张国刚*



·药学研究·

骨痨敌注射液HPLC指纹图谱研究

刘虹霞1，张译丹2，张国刚1*

目的 建立中药复方制剂骨痨敌注射液的HPLC指纹图谱分析方法，对制剂的质量进行控制。方法 采用ECOSIL C18柱(250 mm × 4.60 mm,5 μm)，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，流速：1.0 mL/min，柱温：30 ℃，检测波长：203 nm，进样量：10 μL。结果 通过对25批制剂进行指纹图谱分析，标定出9个共有峰。采用对照品指认了毛蕊异黄酮葡萄糖苷、柚皮苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1 5个色谱峰。并运用“中药指纹图谱计算机辅助相似度计算软件”，计算25批注射液的相似度在0.985 ～ 0.997之间。结论 所建立的HPLC指纹图谱分析方法专属性强、重复性良好，可用于骨痨敌注射液的质量评价。

骨痨敌注射液；指纹图谱；HPLC；质量控制

0 引言

骨痨敌注射液是由5味药材组成的中药复方制剂，其药味分别为黄芪、三七、骨碎补、乳香和没药。骨痨敌注射液具有益气养血、补肾壮骨、活血化瘀的功效，用于骨关节结核、淋巴结核、肺结核等各种结核病以及瘤型麻风病等症。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此,评价其质量应采用与之相适应的、能提供丰富鉴别信息的检测方法，但现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法都不足以解决这一问题。而中药指纹图谱能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价，这也正好符合中医药整体学说。因此，笔者结合相关文献[1-5]，对骨痨敌注射液的HPLC指纹图谱进行研究，为其质量控制方法提供科学依据。

1 仪器与材料

Agilent 1100型高效液相色谱仪(配有DAD检测器，Chemstation system化学工作站，美国Agilent公司)，AE240十万分之一电子天平(瑞士Mettler公司)。

骨痨敌注射剂(规格：2 mL/支，批号：091201、091202、091203、110401、110402、110403、110404、110405、1207001、1207002、1207003、1207004、1207005、1207006、1207007、1207008、1207009、1207010、1208001、1208002、1209001、12009003、1209006、1210001、1210003，沈阳药科大学天然药物化学实验室)，毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号：111920-201102，中国药品生物制品检定所)，柚皮苷(批号：110722-200309，中国药品生物制品检定所)，三七皂苷R1(批号：0745-200006，中国药品生物制品检定所)，人参皂苷Rg1(批号：110703-200726，中国药品生物制品检定所)，人参皂苷Rb1(批号：110704-200217，中国药品生物制品检定所)，娃哈哈纯净水(纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司)，乙腈(色谱纯，天津康科德科技有限公司)，甲醇(色谱纯，天津康科德科技有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：ECOSIL C18柱(250 mm × 4.60 mm，5 μm)，以乙腈为流动相A、水溶液为流动相B，按表1程序进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为203 nm，进样量为10 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备 供试品溶液：取骨痨敌注射液1支，用0.45 μm滤膜滤过，即得。

对照品溶液：取柚皮苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品、三七皂苷R1对照品、人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品各适量，精密称定，分别加10%甲醇溶液制成每1 mL含柚皮苷 0.40 mg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷 0.35 mg、三七皂苷R1 0.35 mg、人参皂苷Rg1 0.50 mg、人参皂苷Rb1 0.25 mg的对照品溶液，用0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.3 共有峰的标定及对照指纹图谱 将25批骨痨敌注射液按“2.1”项的色谱条件进样分析(见图1)，以出现率100%计，取各批次制剂指纹图谱中的典型色谱峰作为共有指纹峰，标定出9个共有峰，并运用“中药指纹图谱计算机辅助相似度计算软件”，采用平均数法生成注射液对照指纹图谱(见图2)。

图1 25批骨痨敌注射液色谱图

2.4 共有峰的指认 与对照品色谱峰对比可以确定：4号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，6号峰为柚皮苷，7号峰为三七皂苷R1，8号峰为人参皂苷Rg1，9号峰为人参皂苷Rb1，色谱图见图3，以6号峰即柚皮苷色谱峰为参比峰。

图2 骨痨敌注射液对照指纹图谱

图3 骨痨敌注射液共有峰指认

2.5 共有峰峰纯度测定 应用DAD检测器，按“2.1”项的色谱条件对供试品溶液进行全扫描，测定各共有峰的峰纯度，结果见表2。各色谱峰的峰纯度均不小于85.0%，表明各共有峰与邻近色谱峰分离度良好，无色谱峰重叠现象。

表2 峰纯度结果

2.6 方法学验证

2.6.1 仪器精密度试验 取同一批(批号：110404)供试品溶液，连续进样6次，按“2.1”项的色谱条件分析，计算各共有峰与参比峰(6号峰)的相对保留时间和相对峰面积，并计算其相对标准偏差(RSD)。结果各色谱峰的相对保留时间的RSD均小于0.2%，相对峰面积的RSD均小于3.3%，表明各色谱峰较为稳定，仪器精密度良好。

2.6.2 重复性试验 取同一批样品(批号：110404)，按“2.2”项平行制备6份供试品，按“2.1”项的色谱条件进样分析，计算各共有峰与参比峰(6号峰)的相对保留时间和相对峰面积，并计算其RSD。结果各色谱峰的相对保留时间的RSD均小于0.3%，相对峰面积的RSD均小于5.0%，表明该方法具有一定重复性。

2.6.3 溶液稳定性试验 按“2.2”项制备供试品溶液，于常温下保存，分别在0、4、8、12、16和24 h进样，按“2.1”项的色谱条件分析，计算各共有峰与参比峰(6号峰)的相对保留时间的RSD均小于0.2%，相对峰面积的RSD均小于4.5%，结果表明，供试品溶液在24 h内对指纹研究无影响。

2.7 相似度分析 运用“中药指纹图谱计算机辅助相似度计算软件”对25批注射液的色谱图进行处理，经色谱峰自动匹配生成骨痨敌注射液的HPLC指纹图谱共有模式，见图4。通过“相似度计算”功能进行色谱图谱样本与对照指纹图谱的相似度评价，结果见表3。25批注射液之间相似度结果良好，说明各批次间注射液差别较小，质量稳定。

图4 25批骨痨敌注射液指纹图谱叠加图

批号相似度批号相似度0912010.98512070060.9910912020.98712070070.9960912030.99312070080.9961104010.99612070090.9971104020.98712070100.9961104030.98712080010.9961104040.99312080020.9961104050.99312090010.99312070010.99612090030.99312070020.98812090060.99312070030.99612100010.99212070040.99012100030.98512070050.987

3 讨论

3.1 检测波长的选择 根据骨痨敌注射液色谱图研究在各波段下的吸收情况，结果显示，203 nm波长下，色谱峰较多，吸收较强，分离也较好，故选定检测波长为203 nm。见图5和图6。

图5 骨痨敌注射液3D光谱图

图6 骨痨敌注射液各波长色谱图叠加图

3.2 梯度洗脱的选择 笔者选择了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水(冰醋酸)等多种流动相系统对注射剂进行梯度洗脱，结果表明，乙腈-水为流动相时各个色谱峰的分离度较好(203 nm检测)，基本达到基线分离，因此，选择此流动相为骨痨敌注射液指纹图谱检测的流动相系统。

3.3 共有峰归属 骨痨敌注射液共确定9个共有峰，其中4号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，为黄芪的有效成分[6]；6号峰为柚皮苷，为骨碎补的有效成分[7]；7、8、9号峰分别为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1，均为三七的有效成分[8]。

[1] 熊明玲,刘凯南,高厚明,等.骨碎补高相液相指纹图谱构建与应用[J].药物研究,2011,20(5):4-5.

[2] 黎琼红,张国刚.三七药材的指纹图谱[J].沈阳药科大学学报,2006,23(4):229-232.

[3] 王二丽,刘巧,陈丹,等.中药黄芪指纹图谱分析研究概况[J].福建分析测试,2005,14(4):2329-2331.

[4] 崔秀明,董婷霞,陈中坚.三七及其混淆品的HPLC指纹图谱鉴定[J].中草学,2002,33(10):941-943.

[5] 谢培山.中药色谱指纹图谱[M].北京:人民卫生出版社,2005.

[6] 邱勇波,刘锦,武飞.黄芪化学成分及药理作用研究进展 [J].中国疗养医学,2011,20(5):435.

[7] 尚振平,赵庆春,潭菁菁,等.骨碎补的化学成分 [J].实用药物与临床,2010,13(4):263-277.

[8] 袁延强.三七的化学成分研究[D].沈阳：沈阳药科大学,2008:8-9.

HPLC fingerprint study of Gu laodi injection

LIU Hong-xia1,ZHANG Yi-dan2,ZHANG Guo-gang1*

(1.School of Traditional Chinese Materia Medica,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110016,China;2.Liaoning Province Shiyan High School,Shenyang 110841,China)

Objective To establish an HPLC fingerprints analysis method for the quality control of the compound Chinese medicine Gu laodi injection.Methods The separation was performed on a ECOSIL C18column(250 mm×4.60 mm,5 μm) by gradient elution with acetonitrile-water as the mobile phase,the flow rate at 1.0 mL/min,the column temperature at 30 ℃,the detection wavelength at 203 nm and the injection volume at 10 μL.Results By the fingerprint analysis of 25 batches of injection,we had pinpointed 9 common peaks.The peaks of calycosin-7-glucoside,naringin,notoginsenoside R1,ginsenoside Rg1 and ginsenoside Rb1 were identified.The similarity of 25 batches of injection was about 0.985 to 0.997 by using traditional Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity calculation software.Conclusion The HPLC fingerprints analysis method is specific and reproducible,and it can be used to assess the quality of Gu laodi injection.

Gu laodi injection;Fingerprint;HPLC;Quality control

2016-08-10

1.沈阳药科大学中药学院，沈阳 110016；2.辽宁省实验中学，沈阳 110841

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201610018