HPLC-MS/MS法同时测定脑血疏口服液中三种成分的含量

杨有林，齐武强,鲁旭娟



HPLC-MS/MS法同时测定脑血疏口服液中三种成分的含量

杨有林1，齐武强2,鲁旭娟3*

目的 采用HPLC-MS/MS法同时测定脑血疏口服液中3种有效成分-芍药苷、黄芪甲苷及丹皮酚的含量。方法 选用Phenomenex Luna C18(100 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；以含10 mmol/mL乙酸铵乙腈溶液(A)、10 mmol/mL乙酸铵水溶液(B)为流动相，梯度洗脱；质谱为ESI源负离子-MRM模式下检测，流速为0.3 mL/min；柱温为25 ℃。结果 芍药苷、黄芩甲苷及丹皮酚3种成分线性范围分别为0.20～2.00 μg (r=0.999 1)、2.00～20.00 μg (r=0.999 0)、1.00～10.00 μg (r=0.998 5)，3种化合物的平均回收率分别为100.1%、97.9%、102.3%。结论 本方法简便、快捷，重现性好，适用于同时测定脑血疏口服液中芍药苷、黄芪甲苷及丹皮酚的含量。

脑血疏口服液；芍药苷；黄芪甲苷；丹皮酚；HPLC-MS/MS

0 引言

脑血疏口服液主要由黄芪、水蛭、牡丹皮、石菖蒲、牛膝、川芎和大黄7味中药材组成。主要用于气虚血瘀所致中风、症见半身不遂、口眼歪斜、舌强语蹇、偏身麻木、气短乏力、舌暗苔薄白或白腻、脉沉细或细数、出血性中风急性期及恢复早期见上述证候者[1]。近年来脑血疏口服液广泛应用于出血性中风的治疗，目前对脑血疏口服液在临床方面研究的相关报道较多[1-3]，对于其方中主要成分含量的报道较少，罗小兰等[4]测定了脑血疏口服液正丁醇提取后残留物的质量，没有测定某种成分的具体含量。

本研究根据中医理论，选择方中黄芪和牡丹皮作为检测药材。黄芪中有效成分黄芪甲苷对脑缺血再灌注后血脑屏障具有保护作用，同时牡丹皮具有清热凉血、活血化瘀之功效，丹皮酚和芍药苷均为其有效成分。故选择上述3种成分作为检测成分。有研究者曾采用HPLC-UV法、HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷的含量[5-6]，但因黄芪甲苷在紫外区仅有末端吸收且不稳定，且本试验同时测定芍药苷、黄芪甲苷和丹皮酚的含量，因此，采用 HPLC-MS/MS法作为测定方法，该方法快速、简便，以控制该制剂的质量。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；Agilent 6410质谱仪(美国安捷伦公司)；电子分析天平(MS104S型分析天平，瑞士梅特勒公司)。

1.2 药品与试剂 脑血疏口服液(批号：120705、120806、120902，规格：10 mL*10支，山东沃华医药科技股份有限公司)，黄芪甲苷对照品(批号：111640-201002)、芍药苷对照品(批号：110736-201136)及丹皮酚对照品(批号：110708-200506)均购于中国药品生物制品检定所，乙腈、乙酸铵均为色谱纯，购于美国Sigma试剂公司，水为娃哈哈纯净水。

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Luna C18(100 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：10 mmol/mL乙酸铵乙腈溶液(A)，10 mmol/mL乙酸铵水溶液(B)，梯度洗脱程序见表1；流速：0.3 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：5 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.2 质谱条件 离子源为ESI源；检测及扫描分别采用负离子检测方式及多反应监测(MRM)方式，雾化器压力为50.0 psig；干燥气温度：400 ℃；毛细管电压：-5 000 V；四极杆温度：100 ℃；干燥气流速：10.0 L/min。检测化合物待测离子参数见表2。

表2 检测化合物离子参数

2.3 溶液的制备

2.3.1 混合标准溶液的制备 精密称定芍药苷、黄芪甲苷及丹皮酚对照品适量，置于棕色量瓶中，溶解并稀释至刻度(50%甲醇)，摇匀，制成混合对照品储备液(质量浓度分别为1.00、10.00、5.00 μg/mL)，吸取混合对照品储备液各0.20、0.40、0.80、1.00、1.60、2.00 mL，用50%甲醇稀释至100 mL量瓶中制成系列混合标准溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。得芍药苷标准溶液的浓度：2.00、4.00、8.00、10.00、16.00、20.00 ng/mL；黄芪甲苷标准溶液的浓度：20.00、40.00、80.00、100.00、160.00、200.00 ng/mL；丹皮酚标准溶液的浓度：10.00、20.00、40.00、50.00、80.00、100.00 ng/mL，置于-20 ℃冰箱冷藏。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密吸取脑血疏口服液0.10 mL置于50 mL量瓶中，加入起始流动相[10 mmol/mL乙酸铵乙腈溶液∶10 mmol/mL乙酸铵水溶液(10∶90)]稀释至刻度，摇匀后静置。吸取5.00 mL溶液置于离心管中，4 000 r/min离心10 min，精密吸取上清液过微孔滤膜，即得。

2.3.3 基质效应 由于脑血疏口服液为保密方，无处方比例，所以未做阴性对照试验，采用“基质效应”试验代替阴性对照试验。取同一批号的脑血疏口服液，根据“2.3.2”中方法制备溶液5份，利用“2.1”项色谱条件与“2.2”项质谱条件进行进样分析，得3种待测化合物的平均色谱峰面积A1 (A1黄芪甲苷、A1芍药苷、A1丹皮酚)；另精密吸取相同批号的脑血疏口服液0.10 mL置于50 mL量瓶中，同时精密加入混合标准溶液Ⅳ 0.10 mL，加入起始流动相[10 mmol/mL乙酸铵乙腈溶液∶10 mmol/mL乙酸铵水溶液(10∶90)]稀释至刻度，摇匀后静置。吸取5 mL溶液置于离心管中，4 000 r/min 离心10 min，精密吸取上清液过微孔滤膜，制备对照样品5份，按“2.1”项下色谱条件及“2.2”项质谱条件进样分析，得到上述待测化合物的平均色谱峰面积A2 (A2黄芪甲苷、A2芍药苷、A2丹皮酚)；此外，精密吸取5份混合标准溶液Ⅳ 0.10 mL，分别置于50 mL量瓶中，制备5份标准溶液样品，按“2.1”项下色谱条件及“2.2”项下质谱条件进样分析，得到各待测化合物的平均色谱峰面积A3 (A3黄芪甲苷、A3芍药苷、A3丹皮酚)。以各待测化合物(A2-A1)与A3的比值(1∶12<1∶3)来衡量基质效应。上述比较结果均符合文献[7]中关于基质效应比值<1∶3的标准。表明在本方法下样品基质对待测物的测定无影响，同时样品中其他化合物对待测物检测无影响。

2.4 标准曲线 精密吸取5 μL上述系列混合标准溶液，根据“2.1”项下色谱条件和“2.2”项下质谱条件进样分析，并记录峰面积。横坐标(m)表示待测物质量，纵坐标(y)表示色谱峰面积，绘制其标准曲线并进行回归计算，回归方程见表3。

表3 回归方程结果

2.5 仪器精密度试验 精密吸取混合标准溶液Ⅳ(芍药苷、黄芪甲苷及丹皮酚的浓度分别为10、100、50 ng/mL)，在“2.1”项色谱条件及“2.2”项质谱条件下进样分析(n=6)，结果显示，上述3种待测样品的峰面积RSD(n=6)依次为1.8%、1.4%、1.1%。

2.6 重复性试验 精密吸取同一批号(120902)脑血疏口服液0.10 mL，根据“2.3.2”中方法制备供试品溶液，并采用“2.1”项色谱条件和“2.2”项质谱条件进样分析(n=6)，芍药苷、黄芪甲苷及丹皮酚的含量RSD(n=6)分别为2.1%、1.9%、2.6%。

2.7 稳定性试验 精密取同一批号(120902)脑血疏口服液0.10 mL，根据“2.3.2”中条件制备1份供试品溶液，放置于室温条件下，并在0、6、12、24、48 h分别进样分析，芍药苷、黄芪甲苷及丹皮酚峰面积RSD(n=5)分别为1.3%、1.4%、0.9%。结果表明，溶液于室温条件下静置48 h仍稳定。

2.8 回收率试验 精密取同一批号(120902)脑血疏口服液0.10 mL (n=6)，精密称定，分别精密加入上述混合对照品储备液(芍药苷、黄芪甲苷及丹皮酚的浓度分别为1.00、10.00、5.00 μg/mL) 0.60 mL，根据“2.3.2”中方法制备为供试品溶液并进行分析，测定3种待测物的回收率，得其平均回收率分别为100.1%、97.9%、102.3%，RSD分别为4.0%、3.1%、5.7%。

2.9 供试品含量测定 取脑血疏口服液3批，每批3份，根据“2.3.2”中方法制备供试品溶液，并采用“2.1”项色谱条件和“2.2”项质谱条件进行测定并分析，采用外标一点法计算上述样品的含量。结果见表4。同时，取混合标准溶液Ⅳ、上述供试品溶液1份，在相同色谱及质谱条件下进样分析，色谱图见图1。

表4 脑血疏口服液中芍药苷、黄芪甲苷和丹皮酚的含量

图1 TLC色谱图

注：A.混合标准溶液，B.脑血疏口服液；Ⅰ.芍药苷，Ⅱ.黄芪甲苷，Ⅲ.丹皮酚

3 讨论

黄芪甲苷一般是在紫外末端吸收(λ=203 nm)，采用ELSD检测器灵敏度不高，干扰较大；在本实验中，由于脑血疏口服液方中药味多，杂质较多，分离难度增大，因此，采用HPLC-UV法或HPLC-ELSD法需多步提取，操作繁琐。此外，方中芍药苷的含量较低。综上，最后确定采用HPLC-MS/MS测定方中芍药苷、黄芪甲苷及丹皮酚的含量。徐洁等[8]采用HPLC-MS/MS测定黄芪甲苷和芍药苷时选择负离子模式测定，由于黄芪甲苷及芍药苷结构中含有多羟基，丹皮酚结构中也含有羟基，能提供[H]+，故该分子呈一定程度的弱酸性，使化合物带有负电荷。本研究主要基于上述理论，并结合各个化合物的结构特点，选择负离子模式检测方法。结果显示，黄芪甲苷与芍药苷负离子的响应值较高，丹皮酚负离子响应较正离子稍低，但能满足检测需要，所以，3种检测化合物均采用负离子模式测定，且专属性强。

由于脑血疏口服液组方保密，方中各成分比例无法可知，所以本实验没有制备阴性溶液，而是采用添加法测定基质效应实验，证明方中其他成分对待测物无干扰。同时，做基质效应实验较阴性对照实验的优势在于其不仅能够反映出其他药物对待测物的干扰，还能反映药材本身所含成分对待测物的干扰。经基质效应实验后证明方中所含成分对待测物基本无干扰。

由于采用负离子检测，条件考察中分别选择甲醇、乙腈有机相。结果显示，选择甲醇作为有机相时，待测物相应信号不稳定且信号稍低，分析原因可能是甲醇分子中含有羟基，也能提供一定的[H]+，由于本研究采用梯度洗脱的方式，造成流动相中甲醇提供[H]+不均匀，且抑制待测物的离子化程度；而乙腈分子中，其含有的N原子可有效结合氢离子，并可加强待测物离子化的效应，因此将乙腈确定为有机相；同时，在流动相中加入一定比例乙酸铵，可有效改善色谱峰峰型。而采用梯度洗脱方式作为色谱条件，可在较短时间内对3种成分的含量进行同时测定，在程序最后回到流动相初始状态平衡色谱柱，能使色谱峰保留时间稳定。

[1] 陈澈,院立新,张根明.脑血疏口服液在脑血管病方面的临床应用和实验研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志,2014,12(8):1005-1006.

[2] 谢道珍,项宝玉,孙怡,等.脑血疏口服液治疗出血性中风的临床研究[J].中西医结合心脑血管病杂志,2007,5(8):690-691.

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[4] 罗小兰,周件贵,谭头兰.脑血疏口服液正丁醇提取物的含量测定[J].黑龙江中医药,2010,1:43-44.

[5] 田丰,邓英杰.HPLC法测定黄芪中的黄芪甲苷含量[J].沈阳药科大学学报,2000,17(1):43-45.

[6] 赵灵芝,朱丹妮,严永清.HPLC-ELSD法测定黄芪中黄芪甲苷的含量[J].药物分析杂志,1999,19(6):403-405.

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[8] 徐洁,谢丽艳,居文政,等.液相串联质谱同时测定艾迪注射液中9种成分[J].中草药,2013,44(5):566-570.

Simultaneous determination of paeoniflorin,astragaloside Ⅳ and paeonol in Naoxueshu liquid by HPLC-MS/MS

YANG You-lin1,QI Wu-qiang2,LU Xu-juan3*

(1.Department of Pharmacy,Maternal and Child Health Hospital of Baoji City,Baoji 721000,China;2.Department of Pharmacy,Traditional Chinese Medicine Hospital of Baoji,Baoji 721000,China;3.Department of Clinical Laboratory,Xi′an Central Hospital,Xi′an 710003)

Objective To develop an HPLC-MS/MS method for simultaneous determination of paeoniflorin,astragaloside Ⅳ and paeonol in Naoxueshu liquid.Methods The chromatographic separation was achieved on a Phenomenex Luna C18column (100 mm×4.6 mm,5 μm) with a mobile phase of 10 mmol/mL ammonium acetate in acetonitrile-10 mmol/mL ammonium acetate solution.The flow rate was 0.3 mL/min and the column temperature was 25 ℃.Results The paeoniflorin,astragaloside Ⅳ and paeonol showed good linearity in 0.20～2.00 μg(r=0.999 1),2.00～20.00 μg(r=0.999 0) and 1.00～10.00 μg (r=0.998 5),and the average recovery rates were 100.1%,97.9% and 102.3%,respectively.Conclusion The method is accurate,sensitive and specific,which can be used for the quality control of Naoxueshu liquid.

Naoxueshu liquid;Paeoniflorin;Astragaloside Ⅳ;Paeonol;HPLC-MS/MS

2016-03-18

1.陕西省宝鸡市妇幼保健院药剂科，陕西 宝鸡721000；2.陕西省宝鸡市中医医院药剂科，陕西 宝鸡 721000；3.西安市中心医院检验科，西安710003

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201610019