外周血T淋巴细胞亚群在EV71型手足口病患者病情判断中的价值

符青松 黄循斌

[摘要] 目的 探讨肠道病毒71（EV71）型手足口病（HFMD）患儿外周血淋巴细胞亚群与病情严重程度的相关性。 方法 选取2011年5月～2014年5月在深圳市龙岗中心医院儿科住院的EV71型HFMD患儿150例，根据《手足口病诊治指南（2013 年版）》分为普通组100例、重症组50例，两组患儿年龄均为2～5岁；选择同年龄段的 90例健康儿童作为对照组。采用流式细胞术检测EV71型HFMD患儿病程第3天及对照组儿童外周血T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+百分数。重症组患儿按手足口病诊治指南规范治疗5 d后再次检测上述相关指标，并与治疗前进行比较。 结果 重症组外周血T细胞亚群 CD3+、CD4+、CD8+百分数较对照组及普通组显著降低，差异均有高度统计学意义（P < 0.01），重症组CD4+/CD8+比值低于普通组及对照组，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；重症组患儿经过规范治疗后外周血T淋巴细胞亚群百分数上升，但与治疗前比较差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 EV71型HFMD患儿存在细胞免疫功能紊乱，外周血T细胞亚群水平变化可能与患儿病情严重程度存在一定程度的相关性。

[關键词] 肠道病毒71型；手足口病；T淋巴细胞亚群；细胞免疫

[中图分类号] R725.622.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（a）-0113-04

Value of peripheral blood T lymphocyte subsets in condition judgment of HFMD

FU Qingsong1 HUANG Xunbin2

1.Department of Laboratory， Longgang Center Hospital of Shenzhen City， Guangdong Province， Shenzhen 518116， China； 2.Department of Pediatrics， Longgang Center Hospital of Shenzhen City， Guangdong Province， Shenzhen 518116， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the peripheral blood lymphocyte subsets and the severity of the disease in children with enterovirus 71-induced hand， foot and mouth disease （HFMD）. Methods one hundred and fifty cases of enterovirus 71-induced HFMD children from May 2011 to May 2014 in Longgang Center Hospital of Shenzhen City were selected， they were divided into common group （100 cases）， severe group （50 cases） according to Hand Foot Mouth Disease Diagnosis and Treatment Guidelines （2013 Edition）， age of children in two groups was 2-5 years old， 90 healthy children with the same age were selected as the control group. Flow cytometry was used to detect the T cell subsets CD8+， CD4+ and CD3+ in the peripheral blood of children with enterovirus 71-induced HFMD in the third days and control group. The related indexes were detected again after 5 days of treatment in the severe group， they were compared with before treatment. Results The CD8+， CD4+ and CD3+ of T cells in severe group were significantly lower than the common group and the control group， the differences were statistically significant （P < 0.01）； the ratio of CD4+/CD8+ in severe group was lower than the common group and control group， the difference was statistically significant （P < 0.01）； the peripheral blood T lymphocyte subsets of the severe group after standard treatment was significantly decreased， but there was no obvious difference compared with before treatment （P > 0.05）. Conclusion There are some cellular immune function disorders in children with enterovirus 71-induced HFMD. The changes of T cell subsets in peripheral blood are correlated with the severity of the disease.

[Key words] Enterovirus 71； Hand， foot and mouth disease； T lymphocyte subsets； Cellular immunity

手足口病（Hand，foot and mouth disease，HFMD）是由多种肠道病毒引起的急性传染病，具有传播迅速、传染性强等特点，引起该病的肠道病毒约有20种，但是其中以柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）、肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）为最常见病原体[1-2]，其中EV71具有嗜神经性，感染后易并发无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、循环衰竭等严重并发症，其病死率相对较高，幸存者常留有严重神经系统后遗症[3]。自1997年来，EV71感染的手足口病在全球范围流行暴发，其中以亚太地区尤为严重，已造成数百万人致病，并已造成数百例患者死亡。2008年，我国已报道488 955例该病患者，其中126例病例为死亡病例，并且统计显示，主要的致病原便是EV71，因此，EV71感染已成为一个公众的健康问题并引起人们关注[4-6]。但是到目前为止，EV71感染的发病机制并不清楚，并且本病目前无特效的治疗方法，因此，深入研究其发病机制对于早期防治本病及评估预后具有重要意义。本实验通过流式细胞仪检测外周血T细胞亚群 CD3+、CD4+、CD8+百分数，探讨其与EV71型HFMD病情严重程度的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年5月～2014年5月深圳市龙岗中心医院（以下简称“我院”）儿科住院的HFMD患儿150例为研究组，根据中华人民共和国卫生部颁发的《手足口病诊治指南（2013 年版）》诊断标准分为两组，其中100例患儿无合并症，作为普通组，男55例、女45例，年龄2～5岁，平均（2.2±1.7）岁；50例患儿出现并发症，作为重症组，男29例、女21例，年龄2～5岁，平均（2.6±1.2）岁。对照组：为我院儿保科正常体检儿90例，男56例、女34例，年龄2～5岁，平均（2.8±0.5）岁。各组性别、年龄、体重比较，差异均无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究取得了研究对象监护人的知情同意，研究方案获得我院伦理委员会的批准。

1.2 纳入标准

①诊断符合国家卫计委颁发的《手足口病诊治指南（2013 年版）》诊断标准，2011年5月～2014年5月于我院儿科住院的HFMD患儿；②咽拭子标本利用实时荧光PCR技术确定病原为EV71或大便病毒检查明确病原为EV71的患儿；③肝肾功能均正常的患儿；④乙肝和丙肝病毒血清指标显示阴性的患儿。

1.3 排除标准

①合并其他病毒感染性疾病的患儿；②就诊时病程≥3 d的患儿；③正在使用糖皮质激素或细胞毒性药物治疗的患儿。④有免疫抑制剂和激素使用史的患儿；⑤有肿瘤、自身免疫疾病、免疫缺陷疾病的患儿；⑥有家族性疾病史及传染病史的患儿。

1.4 观察指标及检测方法

对各组研究对象T淋巴细胞亚群表达水平进行统计比较，并分析其与HFMD发病的关系。

EV71型HFMD患儿病程第3天及对照组儿童清晨空腹抽取静脉血2 mL，缓慢注入含有EDTA抗凝管中。管中依次加入3种抗体10 μL，室温避光孵育25 min，每管加入200 μL溶血素，轻轻吹打，在室温下避光静置15 min，裂解红细胞，观察溶液澄清透明后，加入预冷PBS液1 mL，室温下分离血清（3000 r/min离心10 min），去上清，加入1 mL PBS液摇匀，滴加1%多聚甲醛液100 μL固定，采用美国BD公司的FACS Calibur 四色流式细胞仪检测，并用SimulSet软件自动分析结果，分别得出CD3+、CD4+、CD8+在外周血中的百分数及CD4+/CD8+细胞的比值。

重症组患儿按手足口病诊治指南规范治疗5 d后再次检测上述相关指标，采血保存及测定方法同上。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对文中所得数据进行统计学分析，计量资料以均数标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血T细胞亚群的变化

EV71型HFMD重症组T细胞亚群 CD3+、CD4+、CD8+百分数均低于普通组和正常对照组，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；普通组T细胞亚群CD3+、CD4+百分数分别低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），而普通组CD8+T 细胞与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；重症组CD4+/CD8+比值低于普通组及对照组，差异均有高度统计学意义（P < 0.01），普通组及对照组CD4+/CD8+比值比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

表1 各组外周血T细胞亚群检测结果比较（x±s）

注：与普通组比较，*P < 0.01；与对照组比较，△P < 0.05，#P < 0.01

2.2 HFMD重症组治疗前后外周血T细胞亚群的变化

HFMD重症组患儿治疗后CD3+、CD4+、CD8+百分数上升，但与治疗前比较差异无统计学意义（P > 0.05），且组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；而CD4+/CD8+明显升高，组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

表2 手足口病重症组治疗前后外周血T细胞亚群检测结果比较（x±s）

3 讨论

手足口病是婴幼儿中常见的一种传染性疾病，临床表现为发热、手、足和口腔等部位出现皮疹和溃疡，个别严重的患者还可出现肺水肿、心肌炎和无菌性脑膜炎等危及生命的并发症，引起该病的主要原因是肠道病毒，可引起手足口病的肠道病毒有20来种，但以CVA16和EV71为主要病原体。其中EV71感染已经在包括中国在内的多个国家和地区流行[7-8]，比如2008年在中国报道的4 888 955例手足口病病例，其中还包括126例死亡患者病例中，EV71也是最主要的致病菌，因此，EV71感染已成为目前一个重要的公共健康问题。并且，近年来相关研究还表明EV71感染的HFMD在婴幼儿中发病率较高，尤以3岁以下发病率最高，且易快速进展为重症病例。轻症患者表现为自限性手足口病或者疱疹性咽喉炎，而重症患者可出现肺出血、神经源性肺水肿和脑干脑炎，甚至出现心肺功能衰竭等严重后果[9]。这是因为婴幼儿的免疫功能常处于生理性免疫低下的状态，因此，婴幼儿发病率较高，且易进展为重症型手足口病[10]。EV71感染的发病机制至今尚无明确报道，但有相关研究表明，机体内的某些炎症因子会在EV71感染后表达水平升高，比如IFN-r、Th2、IL-6、IL-8等，并且这些炎症因子表达水平的变化与疾病严重程度和预后具有相关性[11]，通过对细胞免疫完整的小鼠进行研究也发现，在感染了EV71后，缺乏CD4+和CD8+ T细胞的小鼠更容易发展成为重症病例，同样的，通过建立新生小鼠EV71感染模型也发现，感染后IL-6持續升高会引起组织损伤[1]。所有的这些研究均说明了EV71感染致病和发病过程中，细胞免疫具有至关重要的作用，并且目前已有研究表明，在免疫应答过程中，T淋巴细胞有着至关重要的作用[11]。T淋巴细胞根据表型可分为多个亚群，包括CD4+、CD8+ 细胞亚群[12-14]，正常机体下，这两个亚群的数量和CD4+/CD8+ 比值是保持稳定和相互协调的，以维持机体正常的免疫应答，其中。CD4+细胞主要发挥免疫辅助性细胞的作用，即促进体液免疫和细胞免疫，而CD8+发挥细胞毒性细胞或抑制性细胞的作用，即抑制免疫反应，因此，正常情况下CD4+/CD8+ 比值维持动态平衡，从而使机体免疫功能稳定，这也是机体免疫功能得以发挥的重要前提[15-16]。而当婴幼儿感染病毒时，T淋巴细胞亚群数量、比例发生异常，机体免疫功能将紊乱[17]，因此，检测T淋巴细胞亚群对免疫性疾病的发生发展和预后对于临床的治疗和病情的判断具有重要意义。同时，不同T淋巴细胞亚群在EV71感染手足口病中发挥的不同作用也一直是人们关注的焦点，例如有临床研究表明，Th17细胞参与了EV71感染的病理过程，而CD4+和CD8+ T淋巴细胞则与手足口病患者的预后有着密切关系[13]，然而，至今为止，尚无EV71感染手足口病患者T细胞亚群变化的系统分析，而且临床目前也无治疗EV71感染的理想的药物或者防止感染的疫苗，因此，通过本次进一步的研究，将对EV71感染的预防和治疗有着指导作用。

1979年，Reinherz等[18]应用杂交瘤技术制备了多种抗人T淋巴细胞单克隆抗体，这使鉴定T淋巴细胞亚群有了最可靠的实验室指标，其下降则提示该机体免疫功能出现了降低。因此，为探讨外周血淋巴细胞亚群变化在EV71型HFMD患儿中的临床价值，本实验采用流式细胞术检测EV71型HFMD患儿外周血T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+百分数。结果显示EV71型HFMD重症组患儿外周血T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+ 百分数及CD4+/CD8+ 比值均低于普通组和对照组，组间比较差异均有统计学意义。柯江雄等[19]研究亦表明随着病情的加重，CD3+、CD4+、CD8+ 百分数不断降低。本实验上述研究结果提示EV71型HFMD患儿普遍存在细胞免疫功能紊乱，其中重症组细胞免疫功能紊乱更显著。其机制可能是EV71急性感染后，人类主要组织相容性复合体（MHC-Ⅰ）类分子与CD8+ 分子结合，参与T淋巴细胞受体（TCR）/CD3介导的信号传导，启动MHC-Ⅰ类限制型T细胞应答，细胞毒T淋巴细胞活性增强并识别和杀伤病毒感染细胞，在疾病早期即可出现数量减少，随着病情的进展，可引起CD8+杀伤T细胞的不断减少，不能有效地清除病毒感染的细胞，导致病情加重[20-21]。同时，CD4+和CD8+亚群数量的减少，会促使B细胞的分化、抗体合成及抑制细胞毒性T细胞活性等功能减弱，体液免疫功能也相应降低，因此，导致免疫反应平衡严重失衡，从而造成患者组织损伤。本研究还显示HFMD重症组患儿按指南规范治疗后活化T细胞比例虽有上升，但与治疗前比较无明显差异；CD4+/CD8+ 比值较治疗前显著升高。表明重症手足口病患儿细胞免疫功能在短期治疗后不能很快恢复，病情好转后仍需避免合并其他病原体感染。

综上所述，EV71型HFMD患儿存在细胞免疫功能紊乱，尤其是重症病例。监测HFMD 患儿CD3+、CD4+、CD8+ 的百分比和CD4+/CD8+ 比值的动态变化，可作为判断疾病严重程度的临床参考指标。

[参考文献]

[1] Saoji VA. Hand and foot and mouth disease in Nagpur [J]. Indian J Dermatol Venereol Leprol，2008，74（2）：133-135.

[2] 蔡莉芬，孙梅花，王立静，等.EV71感染手足口病患儿外周血检测Treg细胞、TH17细胞、TGF-β、IL-17A的临床意义[J].河北医药，2011，33（8）：1143-1144.

[3] Koroleva GA，Lukashev AN，Khudiakova LV，et al. Encephalomyelitis caused by enterovirus type 71 in children [J]. Vopr Virusol，2010，55（6）：4.

[4] 陈杰，武玲.手足口病患儿外周血T淋巴细胞亚群及免疫球蛋白水平检测结果分析[J].检验医学与临床，2014，（10）：1369-1370，1372.

[5] 孙林春，张兰芳，张利，等.手足口病患儿外周血T淋巴细胞亚群在病程中的变化及临床意义[J].中国综合临床，2013，29（6）：660-663.

[6] 王经伟，孙中运.手足口病患儿外周血淋巴细胞亚群及血清IL-6、IL-10变化的研究[J].天津医药，2012，40（9）：928-930.

[7] 唐汉庆，卢兰，黄月艳，等.手足口病患儿T淋巴细胞亚群和相关细胞因子水平变化的临床意义分析[J].实用临床医药杂志，2014，18（21）：92-94.

[8] 李素华，陈雪夏，林海龙，等.丙种球蛋白对重症EV71感染手足口病患儿细胞因子调节作用的研究[J].医学研究杂志，2013，42（6）：111-115.

[9] Zhang J，Sun J，Chang Z，et al. Characterization of hand foot，and mouth disease in China between 2008 and 2009 [J]. Biomed Environ Sci，2011，24（3）：214.

[10] 赵明奇，连广琬，朱冰，等.手足口病患儿外周血淋巴细胞亚群的研究[J].中国实验诊断学，2010，14（5）：684-686.

[11] Santana MA，Esquivel Guadarrama F. Cell biology of T cell activation and differentiation [J]. Int Rev Cytol，2006， 250：217-274.

[12] Zhou T，Ma LZ，Fu SM. Correlation analysis of hand-foot-month in patients with humoral immunity and its outcomes [J]. Guanglong Med J，2010，31（18）：2434.

[13] 莫扬，李智山.危重症手足口病患儿淋巴细胞亚群的检测[J].中国实验诊断学，2011，15（12）：2044-2045.

[14] Alidoosti M，Hosseini SK，Sharafi A，et al. Outcomes of percutaneous coronary intervention on saphenous vein graft and native coronary vessels [J]. J Tehran Heart Cent，2011，6（3）：143-147.

[15] 刘亚敏，李颖，任彦，等.不同病原感染的手足口病患儿外周血T淋巴细胞亚群分析[J].中华临床感染病杂志，2012，5（3）：175-176.

[16] 农少云，梁娟英，杨晓泉，等.手足口病患儿细胞免疫功能检测的临床意义[J].现代检验医学杂志，2013，28（1）：156-158.

[17] 农少云，梁娟英，扬晓泉，等.手足口病患儿外周血淋巴细胞亚群及免疫球蛋白检测的意义[J].检验医学与临床，2012，9（11）：1287-1288.

[18] Reinherz EL，Schlossman SF. The different iation and function of human T lymphocyte [J]. Cell，1980，19（4）：821.

[19] 柯江雄，陳强，段荣，等.EV71病毒引起手足口病患儿免疫状态变化的研究[J].实验与检验医学，2014，32（2）：5-8.

[20] Diaz-San Segundo F，Sslguero FJ，de Marco MM，et al. Selective lymphocyte depletion during the early stage of the immune response to foot-and mouth disease virus infection in swine [J]. J Virol，2006，80（5）：2369-2379.

[21] 裘宇容，何宗忠，孙德华，等.手足口病患儿T淋巴细胞亚群与CD3+、CD4+、CD8+双阴性调节性T细胞的检测及其临床意义[J].热带医学杂志，2009，9（1）：49-51.

（收稿日期：2015-10-19 本文编辑：任 念）