芹菜素对动脉粥样硬化大鼠氧化应激和炎性反应的影响

陈宁

[摘要] 目的 研究芹菜素對动脉粥样硬化大鼠氧化应激和炎性反应的影响。 方法 将实验用大鼠120只随机分为正常对照组、模型组、芹菜素（20、40、80 mg/kg）预处理组和辛伐他汀（1.8 mg/kg）预处理组。除正常对照组外，其余各组大鼠采用高脂饲料喂养加注射VD3的方法制备大鼠早期动脉粥样硬化模型，造模过程中芹菜素预处理组和辛伐他汀预处理组每天灌胃给药1次，而正常对照组和模型组以等量生理盐水灌胃。12周后，测定各组大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）的活性和丙二醛（MDA）、一氧化氮合酶（NOS）、活性氧簇（ROS）的含量以及血浆中炎症细胞因子[C反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）]的水平，通过HE染色观察主动脉形态学变化并进行主动脉病变分级。 结果 与模型组比较，芹菜素40、80 mg/kg预处理组大鼠血清中SOD、CAT活性显著升高（P < 0.05或P < 0.01），MDA、NOS、ROS含量显著降低（P < 0.05或P < 0.01），芹菜素80 mg/kg预处理组GSH-Px活性显著升高（P < 0.01）；芹菜素40、80 mg/kg预处理组血浆中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著降低（P < 0.05或P < 0.01），且芹菜素80 mg/kg预处理组IL-10水平显著升高（P < 0.01）。主动脉病理性形态学变化显著改善，主动脉病变分级显著降低，以芹菜素80 mg/kg预处理组效果最为显著（P < 0.01）。 结论 芹菜素具有抑制动脉粥样硬化大鼠氧化应激损伤和炎性反应的作用。

[关键词] 芹菜素；动脉粥样硬化；氧化应激；炎性反应

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（a）-0025-04

Effect of apigenin on oxidative stress and inflammatory response in rats with atherosclerosis

CHEN Ning

Department of Emergency， Handan Central Hospital， Hebei Province， Handan 056001， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of apigenin on oxidative stress and inflammatory response in rats with atherosclerosis. Methods One hundred and twenty experimental rats were randomly divided into six groups： normal control group， model group， apigenin （20， 40， 80 mg/kg） pretreatment group and Simvastatin （1.8 mg/kg） pretreatment group. Except the rats in normal control group， the rats of the other groups were taken the method of feeding with high fat and injecting VD3 so as to make the model of rats with early atherosclerosis. During the experiment， the apigenin pretreatment group and Simvastatin pretreatment group were given drugs by intragastric administration， once a day， while the rats in the normal control group and model group were given equal volumed normal saline by intragastric administration. Twelve weeks later， the activity of superoxide dismutase （SOD）， glutathion peroxidase （GSH-Px）， catalase （CAT） and the contents of malondialdehyde （MDA）， nitric oxide synthase （NOS）， reactive oxygen species （ROS） and the levels of inflammatory cytokines [C-reactive protein （CRP）， tumour necrosis factor α （TNF-α）， interleukin 1β （IL-1β）， interleukin 6 （IL-6）， interleukin 10 （IL-10）] in serum were determined； the morphological changes of aorta was observed by HE staining and aortic lesions were graded. Results Compared with model group， the activity of SOD， CAT in serum of apigenin 40， 80 mg/kg pretreatment group was significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）， the contents of MDA， NOS， ROS in serum were significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the activity of GSH-Px in serum of apigenin 80 mg/kg pretreatment group was significantly increased （P < 0.01）； the levels of CRP， TNF-α， IL-1β， IL-6 in plasma of apigenin 40， 80 mg/kg pretreatment group were all significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the level of IL-10 in apigenin 80 mg/kg pretreatment group was significantly increased （P < 0.01）； the histopathological changes were significantly improved， and the aortic lesions were significantly decreased， especially in apigenin 80 mg/kg pretreatment group （P < 0.01）. Conclusion Apigenin has inhibiting effects on oxidative stress damage and inflammatory response in atherosclerosis rats.

[Key words] Apigenin； Atherosclerosis； Oxidative stress； Inflammatory response

动脉粥样硬化（arteriosclerosis）的发生与多种因素有关[1-3]，病理机制复杂，随着近年来研究的深入，发现氧化应激损伤和炎性反应是动脉粥样硬化发生发展的核心机制[4-5]。王爽等[6]和沈建飞等[7]通过动脉粥样硬化大鼠模型研究发现，通过药物抑制氧化应激和炎性反应能够有效改善动脉粥样硬化的发生发展。芹菜素（apigenin）是天然存在的一种黄酮类化合物，广泛存在于蔬菜和水果中，具有明显的抗氧化作用，可消除自由基，保护细胞膜[8]；此外，芹菜素还具有抗炎、抗凋亡等多种药理学作用[9-10]。本实验通过建立动脉粥样硬化大鼠模型，研究芹菜素对动脉粥样硬化大鼠氧化应激和炎性反应的影响。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

芹菜素（陕西慧科植物开发有限公司，批号：140217，纯度≥98%）；辛伐他汀片（山东方明药业股份有限公司，批号：H21023726）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、一氧化氮合酶（NOS）、活性氧簇（ROS）检测指标试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；C反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）试剂盒和苏木精-伊红（HE）染色试剂盒均购自北京博奥森科技有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 实验动物

清洁级雄性SD大鼠，180～220 g，6周龄，购自河北省实验动物中心，动物合格证号：20140524，饲养环境：室温22～25℃，相对湿度65%～70%，光照周期12 h∶12 h。

1.3 仪器

UV762型紫外-可见分光光度计（上海楚定分析仪器有限公司）；倒置光学显微镜（日本Olympus公司）；离心机（德国eppendorf公司）；WD-2102A型全自动酶标仪（北京六一生物科技有限公司）；RM-2135型石蜡切片机（德国Leica公司）。

1.4 方法

1.4.1 动物模型制备[11]与分组 将120只实验用SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、芹菜素（20、40、80 mg/kg）预处理组和辛伐他汀（1.8 mg/kg）预处理组，每组20只。正常对照组给予正常饲料喂养，其余各组大鼠采用高脂饲料喂养加注射VD3的方法制备大鼠早期动脉粥样硬化（动脉粥样硬化）模型；造模开始后，各治疗组分别每天灌胃给药1次，而正常对照组和模型组以等量生理盐水灌胃，共12周。

1.4.2 血清中氧化应激指标的测定 经腹腔注射乌拉坦实施麻醉，开腹经腹主动脉取血，经2000 r/min离心（离心半径4.9 cm），10 min后取血清，按照试剂盒操作方法步骤，通过紫外-可见分光光度计平行测定各组大鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT的活性和MDA、NOS、ROS的含量。

1.4.3 血浆中炎症细胞因子含量的测定 取“1.4.2”所制备的血清，按照酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒操作步骤，通过酶标仪测定各组大鼠血浆中炎症细胞因子CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量。

1.4.4 病理组织学观察及主动脉病变分级 经“1.4.2”取血完成后，剥离全长主动脉，置于4%多聚甲醛液中进行固定，经常规脱水、石蜡包埋、切片（厚度约5 μm）、展片处理后，行常规HE染色，然后于光镜下观察主动脉病变，并参照王伟等[12]研究报道进行分级评分。分级标准：0级：结构正常；1级：内膜有少量泡沫细胞积聚，无明显的凸起斑块；2级：内膜可见大量泡沫细胞积聚，有明显的粥样斑块，部分斑块融合成片；3级：内膜表面几乎全被粥样斑块覆盖，斑块内可见组织坏死、钙化，斑块底部肌层萎缩变薄。

1.5 统计学方法

采用软件SPSS 15.0进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，等级资料比较采用秩和检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芹菜素对动脉粥样硬化大鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活性的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT活性均显著降低（P < 0.01）；而芹菜素40、80 mg/kg预处理组大鼠血清中SOD、CAT活性较模型组显著升高（P < 0.05或P < 0.01），且芹菜素80 mg/kg预处理组GSH-Px活性显著升高（P < 0.05）。见表1。

表1 芹菜素对动脉粥样硬化大鼠血清中SOD、GSH-Px、

CAT活性的影响（U/mL，x±s，n = 20）

注：与正常对照组比较，*P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01；SOD：超氧化物歧化酶；GSH-Px：谷胱甘肽过氧化物酶；CAT：过氧化氢酶；“-”表示无数据

2.2 芹菜素对动脉粥样硬化大鼠血清中MDA、NOS、ROS含量的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠血清中MDA、NOS、ROS含量均显著升高（P < 0.01）；芹菜素40、80 mg/kg預处理组大鼠血清中MDA、NOS、ROS含量均较模型组显著降低（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。

表2 芹菜素对动脉粥样硬化大鼠血清中MDA、NOS、ROS含量的影响（x±s，n = 20）

注：与正常对照组比较，*P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01；MDA：丙二醛；NOS：一氧化氮合酶；ROS：活性氧簇；“-”表示无数据

2.3 芹菜素對动脉粥样硬化大鼠血浆中炎症细胞因子含量的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠血浆中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著升高且IL-10含量显著降低（P < 0.01）；与模型组比较，芹菜素40、80 mg/kg预处理组大鼠血浆中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著降低（P < 0.05或P < 0.01），且芹菜素80 mg/kg预处理组IL-10含量显著升高（P < 0.01）。见表3。

2.4 芹菜素对动脉粥样硬化大鼠主动脉形态学变化及主动脉病变分级的影响

经HE染色并通过显微镜观察发现，正常对照组大鼠主动脉形态结构未见异常：内皮完整，平滑肌细胞呈长梭形，胞核无碎片，未见空泡变性和胶原纤维增生；而模型组大鼠主动脉呈明显病变：内皮细胞受损，可见慢性炎症过程及泡沫细胞形成，可见细胞空泡变性，伴有动脉粥样硬化斑块形成；经芹菜素预处理12周后，动脉粥样硬化大鼠主动脉病变明显改善，其中以80 mg/kg效果最为显著，见图1。经主动脉病变分级发现：模型组大鼠主动脉病变分级2级以上的占85%，较正常对照组病变分级显著升高（P < 0.01），芹菜素80 mg/kg预处理组主动脉病变分级较模型组显著降低（P < 0.05或P < 0.01），见表4。

A：正常对照组；B：模型组；C：芹菜素20 mg/kg预处理组；D：芹菜素40 mg/kg预处理组；E：芹菜素80 mg/kg预处理组；F：辛伐他汀预处理组

图1 芹菜素对动脉粥样硬化大鼠主动脉形态学变化的影响

（HE染色，400×）

3 讨论

动脉粥样硬化的病理机制非常复杂，与多种因素有关，但随着研究的深入，近年来“氧化反应学说”和“炎症学说”已经成为动脉粥样硬化发病机制的主流学说。Fatar等[13]研究发现，动脉粥样硬化的发生与氧化应激损伤关系密切，其在动脉粥样硬化的发生发展过程中具有非常重要的作用。ROS有多种类型，血管细胞中最重要的是超氧阴离子，它本身不破坏血管，但由它生成的其他活性氧以及NO将造成血管壁的损伤，导致斑块的形成、破裂与血栓形成[14-16]。正常生理状态下，活性氧的产生与清除处于动态平衡，但当活性氧生成过多或机体抗氧化酶活性降低时，就会造成活性氧的过剩，进而导致动脉血管的损伤。SOD能够催化还原活性氧生成过氧化氢，并在GSH-Px和CAT的催化作用下进一步还原生成对人体无害的水和氧[17-18]，SOD、GSH-Px和CAT共同构成了机体的抗氧化酶防御系统，它们的活性能够直接反映机体的抗氧化能力。

动脉粥样硬化的另一个重要病理机制为“炎症学说”，Ross[19]研究发现，炎症可以通过多种途径和一系列病理生理变化促进动脉粥样硬化整个过程的发生发展，其中关于细胞免疫参与的炎性反应研究最多，T淋巴细胞广泛存在于动脉粥样硬化斑块处，促进巨噬细胞分泌大量细胞因子，包括促炎症细胞因子CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6，而诱导平滑肌细胞的凋亡，促进动脉粥样硬化发展，并且能够抑制具有机体保护作用的IL-10的分泌[20]。

芹菜素是一种黄酮类化合物，具有明显的抗氧化、抗炎、抗凋亡等多种药理学作用。本研究通过高脂饮食加注射VD3的方法诱导制备动脉粥样硬化大鼠模型进行研究发现，通过芹菜素预处理能够有效抑制主动脉病变，降低主动脉病变级别，改善抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性，降低ROS以及炎症细胞因子CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，并提高IL-10含量，提示芹菜素具有抑制动脉粥样硬化大鼠氧化应激和炎性反应的作用，从而起到抑制动脉粥样硬化发生、发展的作用。

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（收稿日期：2015-10-17 本文編辑：张瑜杰）