L—精氨酸和天然抗氧化剂对缺血性脑卒中防治作用的细胞和动物模型研究

赵亚硕 李砚超 杜立波 赵保路 刘扬 常彦忠

[摘 要] 目的 探讨L-精氨酸（L-Arginine，L-Arg）和天然抗氧化剂搭配组合对脑卒中的防治作用。方法 分别建立细胞的氧糖剥夺（oxygen and glucose deprivation，OGD）模型和小鼠的大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型来模拟脑缺血，通过L-Arg和天然抗氧化剂搭配预处理之后分别检测细胞内活性氧（scavenge reactive oxygen species，ROS）水平、细胞凋亡及信号分子的表达。结果 低浓度L-Arg对细胞活力没有影响，但高浓度L-Arg能损伤细胞并影响Bcl-2和Bax表达。L-Arg和天然抗氧化剂搭配组合能够减轻OGD诱导细胞的损伤，对细胞活力有明显保护作用，清除OGD引起的细胞内产生的ROS增加，减少细胞凋亡和线粒体膜损伤并调节Bcl-2、Bax、caspase3的表达；在小鼠的MCAO模型中研究进一步发现，这个组合可以减轻局灶性脑缺血引起的脑组织损伤和脑组织细胞凋亡，调节Bcl-2和Bax的表达。结论 L-Arg和天然抗氧化剂搭配可以减少缺氧和缺血诱导的神经细胞和动物脑组织的损伤，可能对脑卒中有一定的防治作用。

[关键词] 一氧化氮；天然抗氧化剂；氧糖剥夺；缺血性脑卒中；细胞凋亡

中图分类号：R743.3文献标识码：A文章编号：1009-816X（2016）04-0259-05

[Abstract] Objective To study the preventive and therapeutic effects of L-Arginine （L-Arg） and natural antioxidants on ischemic stroke. Methods The model of oxygen and glucose deprivation （OGD） on cell and the model of Middle Cerebral Artery Occlusion （MCAO） on mice were established to simulate ischemic stroke. Reactive oxygen species （ROS） levels， apoptosis and signaling molecules in cell were detected respectively by a pretreatment with L-Arg and natural antioxidants. Results In vitro， a low concentration of L-Arg showed no effect on the cell vitality， but a high level of L-Arg could impair the cell and affect the expression of Bcl-2 and Bax. A reasonable combination of L-Arg and natural antioxidants could decrease OGD-induced cell damage and provide obvious protection on cell vitality by scavenging reactive oxygen species （ROS）， reducing apoptosis and mitochondrial membrane as well as modulating the expression of related proteins Bcl-2，Bax and caspase-3. In the study of the MCAO model on mice， we further discovered that this combination of L-Arg and natural antioxidants could decrease damage and the apoptosis of brain tissue， and modulate the expression of related proteins Bcl-2 and Bax induced by the focal brain ischemia. Conclusions Since a reasonable combination of L-Arg and natural antioxidants can reduce the damage of nerve cells and animal brain tissue induced by hypoxia and ischemia， it might be beneficial to the prevention and treatment of ischemic stroke.

[Key words] Nitric oxide （NO）； Natural antioxidants； Oxygen and glucose deprivation （OGD）； Ischemia stroke； Apoptosis

我国已经进入老龄化社會，目前全国患有脑卒中，老年痴呆症，心脏病，加上高血脂、高血糖和高血压的人群有3亿多，这严重影响着中国人民的健康水平。近年来，我国的脑卒中发病率急剧上升，如果治疗不及时就会造成长久的运动障碍甚至是死亡，对家庭和社会带来巨大的压力和负担，这将是人们面临的一个严峻的医疗和社会问题。因此，如何预防和治疗脑卒中，不仅是医疗工作者的责任，也是科学研究和健康战线的一个艰巨任务。

一氧化氮（NO）是内皮细胞松弛因子，对血压的调节和心血管健康发挥着重要作用。研究发现利用天然抗氧化剂保护心肌缺血再灌注损伤时，发现天然抗氧化剂可以清除缺血再灌注损伤时产生的氧自由基，调节和促进NO自由基产生，进而保护心肌组织，减弱缺血再灌注损伤[1～4]。经过试验，我们将一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的底物L-精氨酸（L-Arginine，L-Arg）和天然抗氧化剂搭配以后，形成了一个NO和天然抗氧化剂搭配组合，发现在细胞体系和动物组织体系中，既可以产生一定量的NO，又可以清除细胞内活性氧（ROS），从而保护细胞和组织[5]。

我们建立了氧糖剥夺（oxygen and glucose deprivation，OGD）的细胞模型和小鼠的大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型来模拟体外脑缺血，研究了L-Arg和天然抗氧化剂搭配组合对脑卒中的防治作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料：L-Arg购自美国Sigma Chemical公司。山楂提取物、知母提取物和虾青素购自西安清乐生物科技有限公司。将精氨酸、山楂提取物、知母提取物和虾青素按一定比例混合，溶于蒸馏水中，以灌胃的方式喂食动物。

1.2 实验方法：细胞培养和处理：选取人的SH-SY5Y神经胶质瘤细胞，建立细胞的OGD模型来模拟体外脑缺血[6]。用无糖培养基，在无氧的条件下（95% N2+5% CO2）培养细胞。测试L-Arg、L-Arg和天然抗氧化剂搭配组合对细胞进行OGD培养的影响。利用MTT（3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide）法测定细胞活力；采用DCF-DA检测细胞内活性氧ROS水平；采用Rhodamine123染色法测定线粒体膜电位；利用AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡；细胞内Bcl-2，Bax和caspase-3的表达测试采用western-blot方法。

1.3 动物实验：选用20～25g左右C57BL/6健康雄性小鼠，建立脑中动脉局灶性脑缺血模型。将长25mm直径为0.20+0.01mm的线栓，置于1：2500单位的肝素生理盐水中备用。将小鼠一侧的颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉识别并游离；将颈外动脉结扎并剪断，将线栓插入到颈外动脉，通过颈内动脉到达脑中动脉，线栓插入感觉遇到阻力即可，插入的深度大约10mm左右，这样完成小鼠的局灶性脑缺血MCAO模型。缺血60min之后，将线栓从颈内动脉拔出，实现血流再循环，完成血液再灌注过程。将小鼠随机分成三组：对照处理组、L-Arg和天然抗氧化剂搭配组合高剂量组（18mg/d），低剂量组（4.5mg/d），其中对照组灌胃等体积的蒸馏水，每组10例。先将这三组小鼠分别进行灌胃处置10d，之后进行MCAO处理60min 再灌注24h。观察三组小鼠的神经学评价、脑部梗塞面积、Tunel染色，同时用western-blot检测凋亡相关分子的表达变化。

1.4 统计学处理：所有数据用Statisic 6.0软件进行统计分析，数据表达均为（x-±s），多组之间的差异采用单因素方差分析检验，两两比较采用T-test检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外源性的L-Arg对的细胞活活力影响：在SH-SY5Y细胞的研究发现，低浓度的L-Arg能够产生少量的NO，对细胞活力没影响，而高浓度L-Arg反而对细胞造成不利的影响（图1A），并能够影响Bcl-2和Bax蛋白的变化（图1B）。图1 L-Arg对SH-SY5Y细胞的细胞活力及凋亡的影响。

2.2 L-Arg和天然抗氧化剂搭配组合对细胞活力有明显保护作用：在SH-SY5Y细胞的OGD模型中研究发现，L-Arg和天然抗氧化剂搭配组合对细胞活力有明显保护作用（图2A）。安全有效的药物组合浓度（10μg/ml）不仅对OGD诱导的细胞凋亡有防护作用（图2B），同时还能对OGD诱导的细胞内Bcl-2降低和cleaved-caspase-3升高有明显抑制作用（图2C-D）。图2 L-Arg和天然抗氧化剂搭配组合对细胞进行OGD培养体外模拟缺血性脑中风模型细胞活性的影响。

2.3 L-Arg和天然抗氧化剂搭配组合对细胞内ROS和NO的影响：在SH-SY5Y细胞的OGD模型中研究发现，安全有效的药物组合浓度（10μg/ml）能够使细胞产生NO（图3A）。研究結果还发现，安全有效的药物组合浓度还能够抑制细胞内由于OGD产生的ROS（图3B）和线粒体膜电位的改变（图3C）。图3 L-Arg和天然抗氧化剂搭配组合对细胞内NO、ROS和MMP的影响。

2.4 L-Arg和天然抗氧化剂搭配组合对小鼠的局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用：通过小鼠的MCAO模型研究发现，利用L-Arg和天然抗氧化剂搭配组合能显著地改善小鼠的神经行为学损伤（图4A），脑梗死面积减弱（图4B）。进一步的研究表明，L-Arg和天然抗氧化剂搭配组合能够显著地降低缺血损伤侧凋亡细胞的数量（图5A），同时能够抑制Bcl-2的降低和Bax的上升（图5B，C），并且低剂量要明显好于高剂量。图4 L-Arg和天然抗氧化剂搭配组合预处理对MCAO小鼠神经学评分和梗死面积的影响。

从以上细胞和动物试验结果来看，L-Arg和天然抗氧化剂搭配组合对神经细胞缺氧损伤和动物脑缺血再灌注损伤都具有较好的防护作用，对于神经细胞的损伤的保护作用是通过促进细胞内产生NO和清除ROS水平及调节凋亡相关因子Bcl-2、Bax和caspase-3实现的。

3 讨论

NO在生物体内承担着重要的生物功能，NO作为内皮细胞松驰因子，具有舒张血管调节血压的功能[7]。NO是一个重要的细胞通信信号，具有神经生理及神经保护作用，特别是对神经生存和分化发挥着重要作用。对各种损伤导致细胞死亡的危险因素，可以提供不同通路且对细胞有明显的保护作用。NO可以通过调节神经前体细胞增殖和促进神经细胞分化保护神经细胞。在一些模型体系的研究都清楚地证明了NO具有神经生理及神经保护作用[8～11]。但NO的生物效应具有两面性，除具有神经生理及神经保护作用外，当它在脑中以高浓度产生时，可以介导一系列神经病理过程，如神经退行性疾病、炎症及脑缺血再灌注造成损伤[1～4]。

山楂的果实、叶子、花都可入药，包含多种化学成分，如：黄酮类物质，原花青素类（即OPC），有机酸类，三萜酸类，甾酮类等。山楂提取物可以治疗早期充血性心力衰竭、心绞痛、心律不齐、高血压、高脂血症等[12]。现在药理试验表明，山楂提取物可能通过抑制磷酸二酯酶的活性，增加冠状动脉血液流量和心脏的血液输出，减少心脏的耗氧量，保护心脑组织免受缺血再灌注损伤。

蝦青素（3，3'-二羟基-beta，beta-胡萝卜素-4，4'-二酮）属类胡萝卜素，是存在于鱼、虾和藻类中的一种强抗氧化剂，其抗氧化活性大于beta-胡萝卜素的10倍、维生素E的100倍。近年对虾青素功能的研究使我们对其生物活性有了更多的认识。体外实验显示，在神经细胞模型中，虾青素可以降低6-羟基多巴胺诱导的氧化应激、线粒体损伤和细胞凋亡。在脑缺血动物模型中，虾青素通过抑制氧化应激、减少谷氨酸释放和细胞凋亡、降低大脑的自由基损伤、神经退化和脑梗死[13，14]。

知母的有效成分是知母宁，其化学名称为2C-β-D-吡喃葡糖-1，3，6，7-四氢羟基-9H-黄素-9-酮。知母宁含有四个酚羟基的多酚类物质。知母宁具有清热泻火，滋阴润燥，退热消炎，抑菌杀菌，降血糖等作用，最近人们建议把它用于治疗心脏病。知母宁对氧自由基有很强的清除作用，它对大鼠心肌缺血再灌注损伤过程产生的一氧化氮自由基和氧自由基的清除作用以及对心肌缺血再灌注损伤的保护效应[2，4，5]。

我们将L-Arg和天然抗氧化剂山楂提取物、知母宁和虾青素的搭配以后，发现在细胞体系和组织体系中，L-Arg在细胞和组织内可以产生一定量的NO，而在缺氧缺血过程会产生ROS，二者结合形成过氧亚硝基，导致神经细胞组织损伤。天然抗氧化剂山楂提取物、知母宁和虾青素可以清除缺氧缺血过程会产生ROS，产生具有保护作用的NO，发挥松弛血管和信号转导功能。缺氧缺血过程会产生不同种类的ROS，有大有小、有水溶、也有脂溶。山楂提取物、知母宁和虾青素各含有不同天然抗氧化剂，它们可以在水溶和脂溶体系中清除不同ROS，保护和促进产生安全的NO，相互有一定的协同作用，保护了神经细胞，防止缺氧缺血对神经细胞和组织的损伤[4，5]。另外，NO和天然抗氧化剂本身就能够提高机体对ROS的损伤作用[8，15]。NO和天然抗氧化剂还可能参与其他血象改变，比如增加循环中的网状红细胞、白细胞和中性粒细胞，NO是自然杀伤细胞NK的调节剂，可以调节NK细胞的功能，能提高或抑制肥大细胞和中性粒细胞的活化[16，17]。在本研究中发现，这个L-Arg和天然抗氧化剂搭配组合对局部脑缺血引起的脑卒中确实具有较好的防护作用，而且L-Arg和天然抗氧化剂搭配组合对于局部脑缺血引起的脑组织和神经细胞的损伤的保护作用，清除局部脑缺血引起的细胞内产生的ROS，还可以调节局部脑缺血引起的凋亡蛋白Bcl-2，Bax，caspase3表达的影响。这可能L-Arg和天然抗氧化剂的搭配组合提高了动物的整体健康水平而发挥的作用。这也为研制和开发保护神经、防治脑卒中的健康食品和药物提供了有价值的参考。

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