高效液相色谱法测定人血浆中百草枯浓度



高效液相色谱法测定人血浆中百草枯浓度

目的 建立人血浆中百草枯浓度高效液相色谱检测方法，为百草枯中毒患者预后评估、治疗方案选择提供方法学支持。方法 样品处理采用35%高氯酸处理。流动相为0.1mol·L-1磷酸缓冲液(含75 mmol·L-1庚烷磺酸钠)-乙腈(88∶12，三乙胺调pH=3.0)；流速为1.0 mL·min-1；柱温为28℃；检测波长为258 nm。结果 所采用方法在0.2～500 μg·mL-1范围内线性关系良好。平均绝对回收率为100.6%，RSD均小于3%；平均相对回收率为101.31%，RSD均小于6%。日内和日间RSD均小于6%，冻融及冻存后百草枯样品浓度测定结果差异无统计学意义。结论 高效液相色谱检测方法快速，准确、血液中杂质无干扰，适用于百草枯中毒患者血药浓度的分析测定。

百草枯；液相色谱法；血药浓度

百草枯(paraquat，PQ)是目前广泛应用的有机杂环类除草剂，对人畜均具有高毒性[1]。口服中毒为其主要中毒途径，文献[2]报道人口服百草枯死亡率高达50%以上，目前临床尚无有效治疗方法。百草枯经血液循环分布于肺、肝、肾、甲状腺、肌肉中，造成多器官系统功能损害，是百草枯中毒死亡的主要原因[3]。血液中百草枯浓度与救治成活率密切相关，并可早期预测患者预后[4]。对于百草枯的分析检测方法有紫外分光光度法、色谱法、毛细管电泳法等多种方法[5-7]，其提取方法也有液-液萃取法、固相萃取法等多种[8]，但操作繁琐，费时费力，不利于临床实践应用。本文采用简单的蛋白沉淀法处理血浆样本，建立专一、灵敏、快速的高效液相色谱法(HPLC)检测血浆中百草枯浓度，可为评估患者中毒程度，建立百草枯中毒预后判断指标，评价临床治疗方案效果提供方法学支持。

1 资料与方法

1.1 仪器与试剂 福立 FL2200Ⅱ高效液相色谱仪，配有色谱工作站；eppendorf AG22331 minispin plus高速台式离心机；IKA VORTEX genius.3涡旋混合器；梅特勒-托利多 AL-204分析天平；百草枯标准品(上立方联合化工技术研究院 批号20107038)；1-庚烷磺酸钠(国药集团化学试剂有限公司 批号20110511)；乙腈、甲醇、三乙胺均为色谱纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为Utimate·XB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为0.1 mmol-L-1磷酸缓冲液(含75 mmol·L-1庚烷磺酸钠)-乙腈(88∶12，三乙胺调pH=3.0)；流速：1.0 mL/min；柱温28℃；检测波长为258 nm。

1.2.2 标准工作液的配制 精密称取百草枯标准品2.0 mg置于1.0 mL EP管中，以纯水溶解并定容至刻度，得质量浓度为2 000.0 μg·mL-1的百草枯储备液，4℃冰箱内避光储存。用时取储备液用纯水逐级稀释，配成含百草枯质量浓度分别为2、20、200 μg·mL-1的百草枯系列标准溶液。

1.2.3 样品处理 取样品0.5 mL 置EP管中，加入35%高氯酸100 μL，涡漩1 min，低温高速13 000 r/min，离心5 min，取上清液20 μL进行高效液相色谱分析。

1.2.4 方法专一性 分别取空白血浆、200 μg·mL-1百草枯标准溶液、空白血浆+200 μg·mL-1百草枯标准溶液、待测血浆样品，按“1.2.3”项下方法操作，得色谱图，确定百草枯出峰时间，排除血浆中的内源性物质对百草枯测定的干扰。

1.2.5 标准曲线建立 精密吸取百草枯标准溶液适量，分别加入到空白血浆中，得百草枯浓度为0.2、0.5、2、5、20、50、200、500 μg·mL-1的血浆样品。照“1.2.3”项下方法操作后，上述色谱条件下进行分析，分别以浓度(y)对峰面积(x)做线性回归，得血浆百草枯浓度回归方程，并检测百草枯浓度定量下限。

1.2.6 绝对回收率 于空白血浆中加入适量不同浓度百草枯标准溶液，使百草枯浓度分别为2、20、200 μg·mL-1，按“1.2.3”项下方法处理，同时测定相应浓度的百草枯标准溶液。将血浆样品中与相应标准溶液中的百草枯峰面积进行比较，测得绝对回收率。

1.2.7 相对回收率 于空白血浆中加入适量不同浓度百草枯标准溶液，使百草枯浓度分别为2、20、200 μg·mL-1，按“1.2.3”项下方法处理，每个浓度平行测定5份样本，计算相对回收率，评价方法的准确度。

1.2.8 批内和批间精密度 以空白血浆配制2、20、200 μg·mL-1浓度梯度的百草枯系列溶液，按“1.2.3”项下方法处理，此为1个分析批；连续3天，每天测定1个分析批，分别用当日标准曲线计算测得浓度。计算日内和日间的相对标准差(RSD)，评价方法的精密度。

1.2.9 稳定性试验 以空白血浆配制2、20、200μg·mL-1浓度梯度的百草枯系列溶液，按时间分为原点，-20℃冻融1次，冻融2次，-20℃存放1天，存放7天。按“1.2.3”项下方法处理，每个浓度在每个时间点平行测定5份样本，分别用当日标准曲线计算测得浓度，评价-20℃冻融与存放时间百草枯稳定性的影响。

2 结果

2.1 方法专一性 在本实验色谱条件下，血浆中百草枯峰形良好，分离完全，不受血浆内杂质蜂干扰，百草枯保留时间为7 min左右，本方法具有较好的专一性，见图1。

2.2 线性范围与检出限 百草枯的标准曲线回归方程为y=0.000011x-0.9956，r=0.998，y为百草枯的浓度(μg·mL-1)，x为峰面积。表明百草枯在0.2～500 μg·mL-1范围内线性关系良好。最低检出限(S/N=3)可达0.1 μg·mL-1。

2.3 回收率和精密度试验 回收率结果见表1，平均绝对回收率为100.6%，RSD均小于3%；平均相对回收率为101.31%，RSD均小于6%。日内和日间精密度见表2，RSD均小于6%。

表1 百草枯回收率(n=5)

表2 百草枯精密度(n=5)

2.4 稳定性试验 反复冻融及冻存不同时间百草枯样品浓度测定结果见表3、4，三组间及组件两两比较无显著性差异，P值均大于0.05，RSD均小于8%，表明上述条件下百草枯样品稳定。

表3 百草枯冻融稳定性(n=5)

注：与原点比较，◆P>0.05；与冻融1次比较，●P>0.05，三组间比较，P>0.05。

表4 百草枯冻存稳定性(n=5)

注：与原点比较，◆P>0.05；与冻存1次比较，●P>0.05，三组间比较，P>0.05。

3 应用

患者郭某某，男，32岁，体重72 kg，口服20%百草枯溶液50 mL后半小时入院。于入院当时，服毒后6、12、24、36、48 h取血浆，按照“1.2.3”项下方法操作，测定血浆中百草枯浓度，血药浓度时间曲线见图2。可见患者口服百草枯后，血浆中百草枯浓度会随时间推移而显著下降，至48 h 后已难以测出，因此在临床工作中，要及早进行洗胃，导泻，血液灌流及抗氧自由基等综合治疗，尽最大可能挽救患者生命。

4 讨论

百草枯的分子式为C12H14N2，分子量为186.3，纯品为白色结晶，以阳离子形式存在，易溶于水，微溶于乙醇，300℃左右分解，在酸性及中性溶液中稳定，可被碱水解，常用的为20%水溶液。由于其强极性及高沸点，因而液相色谱法尤其是高效液相色谱法是最常用的百草枯检测方法。检测效果和具体分析方法因选择的色谱仪、色谱柱、流动相等的不同而异。通常情况下百草枯液相色谱法选用离子对试剂的流动相、富集特性强的色谱柱，更能获得显著的分析检测结果[9-10]。百草枯生物样品的预处理方法多采用固相萃取法[8]，成本较高且涉及多种化学试剂，步骤繁杂。本实验参照Hara 等[11]，王雷等[12]报道的条件，采用高氯酸直接沉淀蛋白的方法，简便快捷，且沉淀完全，在检测中未见有干扰组分，且获得了较高的回收率，从图1血浆中百草枯色谱图看，血浆中内源性物质多在6 min内出峰，不干扰百草枯的测定。

本方法选用磷酸溶液作缓冲液，庚烷磺酸钠作离子对试剂，乙腈为有机溶剂，同时用有机碱三乙胺调节pH值。结果显示，百草枯峰形良好，保留时间适当，回收率和精密度符合方法学要求，分析过程简单易行，整个检测过程可在30 min内完成。本研究发现，流动相的存放时间可对百草枯保留时间有一定影响，这可能与流动相中乙腈挥发，导致流动相中乙腈比例降低有关。流动相中庚烷磺酸钠的浓度及乙腈比例对百草枯的保留时间影响较大，庚烷磺酸钠浓度降低或乙腈比例升高，都会使百草枯保留时间缩短，且有拖尾现象。当柱温为28℃，流动相中庚烷磺酸钠含量为75 mmol·L-1，乙腈体积比为12%时，百草枯分离良好，同时避免了血浆中杂峰的干扰，能得到较好色谱图。经方法学验证，其灵敏度、专一性、线性范围、精密度、准确度等，符合生物样品分析方法要求，重现性好，可应用于临床百草枯中毒患者的血药浓度快速检测。

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HPLC determination of paraquat concentration in human plasma

SUN Bin LUAN Chunye GUO Lisha ZHUANG Fuju XIA Juanjuan QIU Jianqing

Department of Emergency,Binzhou Medical University Hospital,Binzhou 256603，P.R.China

Objective To establish an HPLC method for determination of paraquat in human plasma to provide methodology support for the assessment of prognosis and choice of therapy of patients with paraquat poisoning.Methods The plasma samples were deproteimized with 35% perchlorld acid.The mobile phase consisted of 0.1 mol·L-1phosphate buffer (75 mmol·L-1sodium heptanesulfonate)-acetonitrile (88:12), adjusted pH to 3.0 by triethylamine,at a flowrate of 1.0 mL·min-1,and the detection occurred at 258 nm, column temperature at 28℃.Results A good linearity was obtained in the concentration range of 0.2～500 μg·mL-1.The average absolute recovery was 100.6%,RSD were less than 3%,average relative recovery was 101.31%,RSD less than 6%.The intra-day and inter-day RSD were less than 6%. After thawing and frozen,concentration of paraquat showed no significant difference.Conclusion HPLC method was rapid, accurate and without interference of impurities, which could be applied in analysis and determination of plasma concentration for patients with paraquat poisoning.

paraquat,HPLC,plasma concentration

山东省医药卫生科技发展计划项目(2013WS0307)

邱建清,E-mail: sbalyf@163.com

孙 斌 栾春业 郭丽莎 庄福聚 夏娟娟 邱建清

滨州医学院附属医院急诊科 滨州 256603

R 595.9

A

1001-9510(2016)05-0342-04

2016-06-21)