Pyk2在结直肠癌中作用机制的初步研究

张宗耐 常迎彬

民航总医院普通外科 北京 100123



Pyk2在结直肠癌中作用机制的初步研究

张宗耐 常迎彬

民航总医院普通外科 北京 100123

目的 探讨富含脯氨酸的蛋白酪氨酸激酶2(Pyk2)在人类结直肠癌中的作用机制。方法 构建有正义Pyk2 cDNA和反义Pyk2 cDNA的质粒pcDNA4.1/Zeocin稳定转染结直肠癌sw480细胞系，利用流式细胞技术(FCM)检测转染组与对照组细胞在凋亡和细胞周期s期细胞分布的差异。结果 转染正义Pyk2 cDNA质粒的sw480细胞凋亡水平明显高于对照组，s期细胞数显著减少；转染反义Pyk2质粒的sw480细胞凋亡水平明显低于对照组，s期细胞数显著增多。结论 Pyk2可能是通过提高结直肠癌细胞的凋亡水平，降低其增殖水平而发挥作用。

结直肠癌；蛋白酪氨酸激酶2；增殖；凋亡；转染

我国结直肠癌的发病率和死亡率均保持上升趋势，2011年结直肠癌的发病率和死亡率分别为23.03/10万和11.01/10万，且发病时多数已属晚期，严重威胁人类健康。富含脯氨酸的蛋白酪氨酸激酶2(Pyk2)是一种非受体酪氨酸蛋白激酶，主要依赖 Ca2+浓度或 PKC 参与细胞内的MAPK、PI3K或JNK等信号通路转导，将胞外信息与胞内效应分子联系起来，催化多种含 SH2 结构域的底物蛋白磷酸化，从而调节细胞的增生与分化、粘附和迁移以及一些转录因子的活性[1-3]。笔者的前期研究显示，Pyk2的表达水平是结直肠癌患者的独立预后因子，高表达是结直肠癌患者预后的有利因素[4]，但其作用机制尚未见报道。本文通过建立稳定转染正义Pyk2 cDNA和反义Pyk2 cDNA质粒的结/直肠癌sw480细胞系，利用流式细胞技术检测Pyk2对细胞凋亡水平和s期细胞分布的差异以探讨其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 结直肠癌细胞系SW480，转化有全长PCDNA4-A-antisense-Pyk2和PCDNA4-A-Pyk2质粒的大肠杆菌，由北京大学第一医院大肠癌实验室惠赠；兔抗人Pyk2多克隆抗体购自Abcam公司；质粒中提试剂盒购自Promega公司；脂质体Lipofectamine2000购自Lifetech公司；凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；FACS Calibur流式细胞仪购自BD公司；DMEM、F12 培养基以及胎牛血清购自Gibco 公司。

1.2 细胞培养 直肠癌细胞系SW480培养条件为10%胎牛血清，DMEM培养基，在37℃，CO2培养箱中进行。

1.3 质粒转染及筛选 按上述方法培养细胞生长至70%～80%融合。质粒DNA(PCDNA4-A-Pyk2，PCDNA4-A，PCDNA4-A-antisense Pyk2)4 μg用250 μL无胎牛血清的DMEM稀释混匀，在另一个EP管中将10 μL脂质体用250 μL无胎牛血清的DMEM稀释混匀，室温孵育5 min，马上将DNA稀释液与脂质体稀释液充分混匀，室温放置20 min，以形成DNA/脂质体复合物，PBS洗细胞2次，加入2 mL无胎牛血清的DMEM培养液，将DNA/脂质体复合物加入培养液中，混匀，37℃，5%CO2培养箱中孵育24 hr后将细胞分瓶传代(细胞密度最好不超过25%，此时Zeocin效果好)，再次放入上述条件细胞培养箱中培养，48 hr更换培养液，加入Zeocin至终浓度100 μg/mL；每2～3天更换培养液,至细胞克隆出现；Zeocin浓度减为50 μg/mL，维持既定的克隆生长6～8周。稳定生长的细胞可传代培养，仍需加50μg/ mL的Zeocin维持筛选。

1.4 转染成功的鉴定 待4种细胞生长铺满细胞培养瓶，常规提取各组细胞蛋白，用Western-blot方法检测转染Pyk2蛋白的表达水平；常规提取各组细胞mRNA，进行RT-PCR，测定转染后Pyk2基因表达水平。

1.5 流式细胞技术检测Pyk2对大肠癌细胞凋亡的影响 调整待测细胞浓度为5×105～1×106个/mL，取1 mL细胞，1 000 rpm，4℃离心10 min，加入1 mL冷的PBS，轻轻振荡使细胞悬浮，1 000 rpm，4℃离心10 min。弃上清，重复步骤3、4次(对于贴壁细胞，先用胰酶消化，再用PBS冲洗)，将细胞重悬于200 μL binding buffer，加入10 μL Annexin5-FITC，轻轻摇匀，避光室温反应15 min或者4℃反应30 min，加入300 μL binding buffer，再加入5 μL PIJ即可上机检测。

1.6 流式细胞技术检测 Pyk2对大肠癌细胞细胞周期分布的影响 用适当的方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性对照组，并收集细胞；用PBS 洗涤细胞一次(离心2 000 rpm，5 min)收集并调整细胞浓度为1×106/mL；制备的单细胞悬液用体积分数为70%乙醇固定，4℃保存，染色前用PBS 洗去固定液(如需要，细胞悬液用200目筛网过滤一次)加100 μL RNaseA 37℃水浴30 min；再加入400 μL PI 染色混匀，4℃避光30 min；上机检测，记录激发波长488 nm 处红色荧光。

1.7 统计学分析 采用SPSS14.0进行统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 稳定转染sw480细胞系的成功构建 稳定转染后各组Pyk2 mRNA表达水平的测定如图1所示：sw480-Pyk2(+)组中Pyk2 mRNA表达水平明显上调，sw480-Pyk2(-)组中Pyk2 mRNA表达水平明显下调，而sw480-vector中Pyk2 mRNA的表达水平则无明显变化，这证明建立了稳定转染的高表达和低表达Pyk2的sw480细胞系。

图2示转染后sw480细胞Pyk2蛋白的表达。sw480-Pyk2(+)组中Pyk2蛋白表达较对照组sw480明显增加，sw480-Pyk2(-)组中Pyk2蛋白表达明显降低，差异具有统计学意义；sw480-vector中Pyk2蛋白表达水平则与对照组无差异，证明建立了稳定转染的高表达和低表达Pyk2的细胞系。

2.2 流式细胞技术检测转染后各组细胞凋亡水平的变化 与对照组sw480细胞相比，sw480-Pyk2(+)组大肠癌细胞凋亡率明显提高，sw480-Pyk2(-)则明显降低(P<0.05)，而sw480-vector组则无明显变化(P>0.05)，见图3。

2.4 流式细胞技术检测转染后各组细胞细胞周期分布变化 与对照组sw480细胞相比，sw480-Pyk2(+)组大肠癌细胞被阻滞于G0/G1期，分布于S期的细胞减少；而sw480-Pyk2(-)组中分布于S期的细胞则增多，sw480-vector组大肠癌细胞在细胞周期分布上与对照组相比无明显变化，见图4。

3 讨论

肿瘤不仅是细胞增生异常的疾病，也是肿瘤细胞死亡异常的病理状态。肿瘤的生长本身就是细胞增殖和凋亡失去平衡的结果。一系列研究表明，肿瘤细胞的增殖和凋亡之间存在联系[5]。许多与细胞增殖、周期调节有关的基因及信号转导通路同时也是调节细胞凋亡的重要因素[6]。因为细胞增生与细胞凋亡间的不平衡被认为是导致肿瘤的关键因素，大量的研究集中于如何改变从癌前病变发展为癌的凋亡通路。

目前对Pyk2 表达与凋亡的关系研究提示Pyk2 在诱导凋亡的过程中发挥着一定的作用。Xiong 等[7]报道在几种纤维母细胞和上皮细胞系中有异位表达的Pyk2 引起凋亡，而且Pyk2 表达的缺失能导致对生理性凋亡的抵抗。Chauhan 等[8]在多发性骨髓瘤细胞中研究发现，由地塞米松诱导的凋亡过程与Pyk2 的活化有关，首次在多发性骨髓瘤细胞中发现了地塞米松依赖Pyk2 诱导凋亡的信号通路。Ueda 等[9]报道发现一种与FAK 家族的激酶相互作用的蛋白FIP-200，其通过与Pyk2 的激酶活性区结合而抑制Pyk2 激酶的活性，在大鼠细胞中FIP-200 与Pyk2 形成的复合体能抑制Pyk2 诱导的凋亡。

Pyk2是一种非常活跃的酪氨酸蛋白激酶，可被多种细胞外的信号所激活，参与MAPK，c-JNK以及PI3K-Akt等信号传导通路。Pyk2在调控细胞增殖、凋亡、细胞骨架结构等细胞事件中发挥着重要作用。我们的早期研究发现，Pyk2蛋白在大肠癌组织中定位于大肠癌细胞的胞浆当中，其表达水平与大肠癌分化程度以及TNM分期呈显著相关，这表明Pyk2表达水平能够反映大肠癌的恶性程度[4]。细胞凋亡在肿瘤发生中具有重要作用[10]。笔者在以往研究的基础上，构建正义和反义Pyk2的真核表达质粒载体pcDNA4.1/Zeo及空载体经脂质体稳定转染大肠癌sw480细胞系，内源性控制大肠癌细胞中Pyk2的表达水平，检测发现，与对照组细胞相比，sw480-Pyk2(+)组大肠癌细胞凋亡率明显提高，并且该组细胞被阻滞于G0/G1期，s期细胞所占比例减少(P<0.05)；sw480-Pyk2(-)组大肠癌细胞调往率明显降低，并且该组细胞增殖加快，s期细胞所占比例增加(P<0.05)； sw480-vector组细胞的凋亡和增殖则没有明显变化(P>0.05)。提示Pyk2与大肠癌细胞的生物学行为有密切关系，它能够促进癌细胞的凋亡，抑制大肠癌细胞从静息状态(G0/G1)到S期过渡，从而抑制大肠癌细胞的增殖。这进一步印证了Pyk2可能是大肠癌发生发展的关键基因，它起着抑癌作用。

目前，Pyk2在肿瘤发生发展中的具体机制尚不十分明了，本研究认为，Pyk2可能是通过促进大肠癌细胞的凋亡，抑制其增殖而发挥其抑癌作用，这为进一步研究Pyk2在大肠癌中的作用打下了坚实基础。

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The preliminary study on the mechanism of Pyk2 in colorectal cancer

ZHANG Zongnai CHANG Yingbin

General Surgery Department,Civil Aviation General Hospital,Peking 100123，P.R.China

Objective To explore the mechanism of proline-rich protein tyrosine kinase-2 (Pyk2) in human colorectal carcinoma.Methods Recombined plasmids pcDNA4.1/Zeocins constructed with sense and antisense Pyk2 cDNA were stably transfected into sw480 cells, respectively.The changes in apoptosis and cell cycle were determined by Flow cytometry (FCM).Results The apoptosis rate of SW480 cells transfected with Pyk2 cDNA plasmid was significantly higher than the control group, the number of cells distributed in s stage decreased significantly; while the apoptosis rate of cells transfected with antisense Pyk2 plasmid was significantly lower than that of the control group,and the number of cells distributed in s stage increased significantly.Conclusion Pyk2 could up-regulate the apoptosis level of sw480 cells,while lower its proliferation .

colorectal carcinoma,Pyk2,proliferation,apoptosis,transfection

常迎彬,E-mail: annianzhang@126.com

R735.3

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1001-9510(2016)05-0330-03

2016-05-09)