硫化氢对慢性应激抑郁模型大鼠行为及海马SOD活力和MDA含量的影响

刘红霞 王 华 于腊梅 郭 莉

滨州医学院基础医学院生理学教研室 烟台 264003



·论著·

硫化氢对慢性应激抑郁模型大鼠行为及海马SOD活力和MDA含量的影响

刘红霞 王 华 于腊梅 郭 莉

滨州医学院基础医学院生理学教研室 烟台 264003

目的 观察硫化氢(H2S)对慢性应激抑郁模型大鼠行为和海马组织氧化应激的影响。方法 雄性健康成年Wistar大鼠，随机分为正常对照组、应激抑郁(chronic unpredictable mild stress，CUMS)组、CUMS+低剂量NaHS(CUMS+L-NaHS)组、CUMS+高剂量NaHS(CUMS+H-NaHS)组。采用CUMS加孤养复制大鼠抑郁模型。用强迫游泳实验检测大鼠行为学变化，用比色法检测海马组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)的含量。结果 与正常对照组比较，CUMS组大鼠强迫游泳不动时间显著延长，海马区SOD活性减低，MDA含量增高；与CUMS组比较，CUMS+L-NaHS组、CUMS+H-NaHS组大鼠强迫游泳不动时间均明显缩短，海马区SOD活性明显升高，MDA含量均明显下降。结论 H2S供体NaHS对慢性轻度不可预见性应激诱导的抑郁模型大鼠具有抗抑郁作用，其机制与提高大鼠的抗氧化应激能力有关。

硫化氢；抑郁症；超氧化物歧化酶；丙二醛；氧化应激

抑郁症患者表现出情感障碍及学习和记忆能力受损，有研究报道，抑郁症患者脑组织存在脂类的氧化性损伤[1]，这是由于脑组织是动物氧代谢水平最高的组织，当脑内发生创伤性损伤或病理性损伤(例如抑郁症)时将会产生大量的氧自由基[2]。海马是与情绪和学习记忆功能密切相关的脑区，也是应激易累及损伤的靶区[3-4]，且MRI显示海马体积缩小萎缩的程度与抑郁发作的频率和抑郁未治疗的持续时间有关[5]。硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)具有抗氧化应激、细胞凋亡及神经系统炎症等神经保护作用[6]。本实验通过建立慢性不可预知性温和性应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)模型，腹腔注射硫化氢供体NaHS进行抗抑郁治疗，观察应激前后及注射NaHS前后大鼠行为学变化，海马区超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活力及丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量变化，探讨H2S对慢性抑郁障碍的防治作用，为临床抑郁症的诊治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验药品、试剂及仪器 NaHS购于Sigma公司；SOD和MDA检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；Uv-VIS spectrophotometer(U-1800型，日本Tokyo)全自动分光光度计；高速台式低温离心机(TGL-16M，美国Beckman)。

1.2 实验动物、动物分组及给药 实验选用雄性健康成年Wistar大鼠(青岛市药检所动物中心提供)，体质量为280～300 g。适应性饲养大鼠1周，自由进食饮水，室温为(20±3)℃。实验前，用旷场实验对大鼠进行行为学评分，选择各项行为学得分相近的大鼠随机分为正常对照(control)组、应激抑郁(CUMS)组、CUMS+低剂量NaHS(CUMS+L-NaHS)组、CUMS+高剂量NaHS(CUMS+H-NaHS)组，每组10只。低剂量与高剂量NaHS治疗组每天分别腹腔注射1.68、5.6 mg·kg-1NaHS。给药从造模第15天开始，所有大鼠连续给药14天。正常对照组和CUMS组每天腹腔注射生理盐水(按5 mL/kg 注射)。

1.3 抑郁模型的建立 根据文献[7]建立模型，并加以改进。正常对照组大鼠正常条件饲养；其余3组大鼠用慢性不可预知性温和性应激刺激进行抑郁造模，大鼠单笼饲养，进行28天随机应激，包括足底电击(强度10 mA，间隔1 min刺激1次，持续刺激10 s，共30次)、热水游泳(45℃，5 min)、冰水游泳(4℃，5 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)、鼠笼倾斜(24 h)、潮湿垫料(24 h)、水平摇晃(5 min)和夹尾(1 min)共9种刺激方法，每日给予1种刺激，每种刺激≥2次，同种刺激不能连续出现，使大鼠不能预测刺激的发生，以避免发生适应性。

1.4 大鼠强迫游泳实验(forced swimmingtest，FST) 将动物动作轻柔地单独置于大鼠强迫游泳圆筒内，桶内装水，桶高度70 cm，内径 30 cm ，水面高度35 cm，水温23～25°C，用摄像头采集测试影像，共测试6 min，前2分钟作为大鼠适应阶段，后4分钟纳入不动状态的时间统计。不动状态的标准为大鼠漂浮或者仅有细小肢体运动，沿圆筒壁攀爬和挣扎不列入标准。每只大鼠测试前，更换一次游泳用水，避免重复用水对测试大鼠产生影响。游泳结束后，毛巾擦干大鼠，放回笼中。用漂浮不动时间作为判断大鼠抑郁严重程度的指标。

1.5 海马组织SOD和MDA含量测定 行为学实验完成后，断头处死大鼠，在冰上迅速取出全脑并分离海马组织，在预冷的生理盐水中漂洗，滤纸吸干，称重，按质量加9倍的生理盐水将脑组织制成匀浆，低温离心3 000转/ min，共15 min，取上清液，按照SOD、MDA试剂盒说明书检测SOD活性和MDA含量。样品具体处理过程及检测方法均按试剂盒说明书进行，最后读取各管吸光度值并计算数值。

2 结果

2.1 造模前后及硫化氢治疗后各组大鼠强迫游泳指标变化 与正常对照组比较，CUMS组大鼠强迫游泳不动时间显著延长(P<0.01)；与CUMS组比较，CUMS+L-NaHS组、CUMS+H-NaHS组大鼠强迫游泳不动时间均明显缩短(P<0.01)(图1)。

##P<0.01，与正常组比较；**P<0.01，与CUMS组比较。

图1 各组大鼠强迫游泳实验中不动时间比较

2.2 造模前后及硫化氢治疗后各组大鼠海马SOD和MDA含量变化 经过28天慢性不可预知性温和性应激刺激后，与正常对照组相比较，CUMS组大鼠海马区SOD活性减低(P<0.01)，MDA含量增高(P<0.01)，具有显著性差异；与CUMS组相比，CUMS+ L-NaHS组、CUMS+ H-NaHS组大鼠海马区SOD活性明显升高(P<0.01)，MDA含量均明显下降(P<0.05)(图2、3)。

##P<0.01，#P<0.05与正常组比较；**P<0.01，与CUMS组比较。

图2 各组大鼠海马区SOD活力的比较

##P<0.01，#P<0.05与正常组比较；*P<0.05，与CUMS组比较。

图3 各组大鼠海马区MDA含量的比较

3 讨 论

抑郁症是一种严重影响人类身心健康的神经精神性疾病。慢性轻度不可预见性应激(CUMS)抑郁大鼠模型[7]与人类抑郁症中慢性低水平的应激源促进抑郁症的发生发展机理较为接近，具有合理的理论基础，可模拟抑郁症患者的部分发病原因与临床症状，被国内外学者广泛应用于抑郁症病理生理机制研究。本实验采用了单笼孤养结合慢性轻度不可预见性应激建立抑郁大鼠模型。大鼠强迫游泳实验是置于局限环境(如水中)中的动物在该环境下拼命挣扎试图逃脱而又无法逃脱，测试过程中会表现出行为上的“不动状态”，记录该“不动状态”的时间，即可以反映出动物的行为绝望状态。不动时间越长，表示大鼠行为绝望状态越严重，越倾向于抑郁症。这种行为绝望状态与抑郁症的表征相类似，并且可以灵敏地反映抗抑郁药物的效应，所以被广泛应用于抗抑郁药物的药效学评价。本实验以强迫游泳实验中不动时间作为大鼠绝望行为的客观指标，通过28天的单笼孤养结合慢性轻度不可预见性应激刺激，与正常对照组比较，抑郁组大鼠表现出强迫游泳不动时间明显延长，表明大鼠抑郁模型复制成功。本实验亦发现，造模过程中给予腹腔注射NaHS的两组大鼠强迫游泳不动时间较模型组均缩短，该结果提示H2S的外源性供体NaHS具有抗抑郁作用。

有研究发现抑郁症可引起体内神经内分泌系统的功能变化，并伴有氧化/抗氧化应激系统失衡，引起中枢神经系统的氧化损伤[1]。应激使机体代谢异常产生大量自由基，过量的自由基超过了抗氧化系统的还原能力，导致机体损伤。MDA是不饱和脂肪酸在自由基作用下发生脂质过氧化反应时产生的代谢产物，其含量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映应细胞损伤的程度[8]。SOD是内源性抗氧化酶，可清除自由基，保护细胞免受自由基的损伤，其活力的高低可反映机体清除氧自由基的能力。因此，通过测定MDA 的含量和SOD酶的活性可反映脑缺血损伤时氧化和抗氧化的程度。脑组织代谢旺盛，耗氧量较大，含有丰富的脂质，对氧自由基引起的损伤更为敏感，氧自由基引起的氧化损伤是脑部结构及功能继发性损害的主要原因之一。海马是与学习记忆和情绪行为功能密切相关的重要脑区，也是应激易累及损伤的靶区，抑郁症患者的海马体积减小，海马神经元变性、坏死[9-10]。有实验证实抑郁模型大鼠皮层和海马组织中的SOD的活性下降，MDA含量增加[11]。本研究结果显示慢性应激抑郁模型大鼠海马组织中SOD活性明显降低，而脂质过氧化产物MDA含量明显升高，提示慢性应激抑郁模型大鼠体内氧化与抗氧化系统失衡，与以上研究结果相一致。

H2S是一种具有臭鸡蛋气味的气体，在体内1/3以气体形式存在，2/3以NaHS 形式存在[12]。20世纪80年代末，人们发现在生理状态下脑组织中可检测到H2S 的存在。近年来，大量文献报道H2S 调节多种中枢神经系统功能，如参与神经元兴奋、学习和记忆的调节等。其作用机制主要涉及抗氧化、抗炎症及抗凋亡等作用[6]。Kimura等[12-13]研究发现H2S 可通过提高细胞内的谷胱甘肽水平，提高抗氧化酶活性，抗脂质过氧化损伤，清除自由基而使细胞避免氧化应激。本研究中CUMS造模过程中给予腹腔注射NaHS的两组大鼠与CUMS组大鼠相比，海马组织中SOD活性增加，MDA含量下降，提示H2S的外源性供体NaHS抗抑郁作用可能与其增强抗氧化酶活性和抗脂质过氧化有关，与以上研究结果一致。

综上所述，H2S供体NaHS对慢性轻度不可预见性应激诱导的抑郁模型大鼠具有抗抑郁作用，其抗抑郁机制可能与提高脑部抗氧化酶的活性，清除脑部自由基，改善机体氧化/抗氧化应激平衡状态有关。

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The effect of hydrogen sulfide on the behavior and SOD activity and MDA content of hippocampus in rats with chronic stress depression

LIU Hongxia WANG Hua YU Lamei GUO Li

Teaching and Research Section of Physiology,School of Basic Medical Sciences,Binzhou Medical University,Yantai 264003,P.R.China

Objective To observe the effects of hydrogen sulfide (H2S) on the behaviors,SOD (superoxide dismutase, SOD) activity and MDA (malonaldehyde,MDA) content of hippocampus in chronic stress depression rats.Methods Healthy male Wistar rats were randomly separated into normal control group,CUMS group,CUMS+L-NaHS group,CUMS+H-NaHS group.A rat depression model was induced by CUMS.Behaviors of rats were assessed by forced swimming test and UV spectrophotometer analysis technique was used to detect SOD activity and MDA content of hippocampus.Results Immobility time of rat in forced swimming test increased,SOD activity decreased and MDA content increased in the CUMS group rats.NaHS treatment could partly reverse these changes.Conclusion NaHS, the donor of H2S,could relieve the depression induced by CUMS in rats, and the mechanism may be correlated to increasing the antioxidative stress ability of rats.

hydrogen sulfide,depression,superoxide dismutase,malonaldehyde,oxidative stress

山东省自然科学基金(ZR2013HL009)；烟台市科技发展计划项目(2012ZH248)

R338.2

A

1001-9510(2016)05-0321-04

2016-07-05)

刘红霞，E-mail: liuhongxia3210@163.com