HPLC测定心脉隆注射液中3组分的含量

邵维在，段治尚，万德生，阙玉玲，周永斌

（云南腾药制药股份有限公司研发部，云南腾冲679100）

HPLC测定心脉隆注射液中3组分的含量

邵维在，段治尚，万德生，阙玉玲，周永斌

（云南腾药制药股份有限公司研发部，云南腾冲679100）

目的：建立心脉隆注射液中尿嘧啶，次黄嘌呤，肌苷的含量测定方法。方法：采用HPLC法对心脉隆注射剂中3组分进行含量测定，色谱柱∶Agilent C18色谱柱；流动相∶0.05 mol/L乙酸钠缓冲液（pH 5.0）为流动相A，甲醇-0.05 mol/L乙酸钠缓冲液（pH 5.0）（80∶20）混合液为流动相B，进行梯度洗脱；流速∶0.5 mL/min；检测波长∶254 nm；柱温∶30℃。结果：尿嘧啶，次黄嘌呤，肌苷分别在0.038～2.404 μg，0.055～3.524 μg，0.089～5.716 μg范围内呈现良好的线性关系，r=0.999 97、r=0.999 94、r=0.999 92；尿嘧啶平均回收率为99.30%，RSD=1.22%（n=9）；次黄嘌呤平均回收率为99.39%，RSD=0.91%（n=9）；肌苷平均回收率为99.61%，RSD=0.93%（n=9）。结论：此法简便、准确，适用于心脉隆注射液中3种成分的同时测定。

心脉隆注射液；尿嘧啶；次黄嘌呤；肌苷

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.004

心脉隆注射液是由美洲大蠊〔1-2〕干品经过浸渍、减压浓缩、分离得到心脉隆浸膏再溶解后制得，有效成分为小分子肽类、复合核苷碱基和结合氨基酸类等〔3〕，具有促进心肌细胞Ca2+内流，温和持久地增加心肌收缩力，扩张血管，降低肺动脉压、肺毛细血管压〔4〕；扩张冠脉、增加冠脉流量〔5〕，抑制氧自由基介导的心肌损伤；扩张肾血管、增加肾血流量、利尿；改善微循环；纠正神经内分泌失衡〔6〕。主治慢性充血性心力衰竭引起的心悸、浮肿、气短、面色晦暗、口唇发绀等症状〔7〕。本文对心脉隆注射液3组分尿嘧啶，次黄嘌呤，肌苷含量测定方法进行再研究，完善心脉隆注射液的质量标准，为有效控制产品质量提供科学依据。

1　仪器与试药

三用紫外仪ZF-2型（上海市安亭电子仪器厂）；美国Agilent-1100液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；UV1700紫外分光光度计（岛津苏州有限公司）；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂Agilent C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；电子分析天平AE240（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；数显恒温水浴锅DRHH-S4（上海双捷实验设备有限公司）；尿嘧啶对照品（中国食品药品检定研究院，批号∶100469-201308，供含量测定用）；次黄嘌呤对照品（中国食品药品检定研究院，批号∶140861-200903，供含量测定用）；肌苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号∶140669-201305，供含量测定用）；心脉隆注射液3批（批号∶140681、140682、140683，云南腾药制药股份有限公司生产）。

2　试验方法与结果

2.1色谱条件色谱柱Agilent C18色谱柱（250 mm× 4.6 mm）；流动相A为0.05 mol/L乙酸钠缓冲液（pH 5.0），流动相B为甲醇∶流动相A（80∶20），按表1进行梯度洗脱；检测波长254 nm，流速0.5 mL/min，进样量10 μL〔8〕。理论板数按尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷峰计算均应不低于5 000。

表1　HPLC法测定心脉隆注射液梯度洗脱程序表

2.2对照品溶液的制备精密称取尿嘧啶对照品15.03 mg、次黄嘌呤对照品22.02 mg、肌苷对照品35.72 mg，置50 mL量瓶中，加流动相A使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密取10 mL置100 mL量瓶中，加流动相A至刻度，摇匀，即得（每1 mL中含尿嘧啶30.06 μg、次黄嘌呤44.04 μg、肌苷71.44 μg）。

2.3供试品溶液的制备精密量取本品1 mL，置50 mL量瓶中，加流动相A至刻度，摇匀，即得。

2.4阴性对照溶液的制备按处方量取除心脉隆浸膏外的其他药材和辅料，按制法制备阴性样品，按“2.3”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行检测。结果在对照品出峰位置未见其它杂质干扰峰，说明处方中其他成分对尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷的测定无干扰。见图1～3。

图3　“心脉隆注射液”供试品HPLC色谱图

2.5线性范围的考察精密吸取对照品储备液适量，加流动相A制成尿嘧啶浓度为3.760，7.510，15.025，30.050，60.100，120.200，240.400 μg/mL，次黄嘌呤浓度为5.506，11.013，22.025，44.050，88.100，176.200，352.400 μg/mL，肌苷浓度为8.930，17.860，35.725，71.450，142.900，285.800，571.600 μg/mL的对照液，按上述色谱条件进行测定。分别以3组分的进样量为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷的回归方程分别为Y=79.802 965 5X+47.529 797（r=0.999 97）；Y=82.299 309 9X+87.022 488（r=0.999 94）；Y= 42.998 944 7X+100.221 86（r=0.999 92）。结果表明，3组分浓度分别在0.038～2.404 μg；0.055～3.524 μg；0.089～5.716 μg范围内线性关系良好〔9〕。

2.6精密度试验精密吸取对照品溶液制备项下的尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷对照品溶液连续进样6次，每次10 μL，按“2.1”色谱条件进样，分别测定尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷的峰面积，计算精密度。结果尿嘧啶峰面积的RSD=0.03%（n=6），次黄嘌呤峰面积的RSD=0.10%（n=6），肌苷峰面积的RSD=0.08%（n=6），表明尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷进样精密度均良好〔10〕。

2.7稳定性实验取同一批号（批号∶140681）样品制备的供试品溶液，并分别于0、1、2、4、6、8、12、24 h按“2.1”项下色谱条件进样1次，测定峰面积。结果∶尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷峰面积RSD分别为1.54%、1.25%和1.77%，表明供试品溶液在24 h内稳定〔11〕。

2.8重复性实验取同一批号样品（批号∶140681）6份，按“2.3”项下方法制成供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样，测得尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷的含量分别为1.230 7 mg/mL、2.434 3 mg/mL、3.189 1 mg/mL，RSD分别为0.98%（n=6），1.14%（n=6），1.21%（n=6）。表明测定结果的重复性良好。

2.9加样回收率试验取同一批号样品（批号∶140681）9份，每份精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中。精密加入对照品溶液1、2、3 mL各3份（含尿嘧啶0.502 1 mg/mL、次黄嘌呤1.000 3 mg/mL、肌苷1.301 2 mg/mL），按“2.3”供试品溶液制备方法制备，并按“2.1”色谱条件测定。结果尿嘧啶平均回收率为99.30%，RSD=1.22%（n=9）；次黄嘌呤平均回收率为99.39%，RSD=0.91%（n=9）；肌苷平均回收率为99.61%，RSD=0.93%（n=9），均符合定量分析的要求〔12〕。见表2～4。

表2　尿嘧啶回收率试验结果（n=9）

表3　次黄嘌呤回收率试验结果（n=9）

表4　肌苷回收率试验结果（n=9）

2.10样品的含量测定依法对3批样品（20140681、20140682、20140683）进行含量测定。见表5。

表5　样品含量测定结果

3　讨论

心脉隆注射液历经15年的研究开发，自1992年云南腾药制药股份有限公司与大理大学合作开发，并由大理大学药理学专家李树楠教授及中科院昆明植物研究所生化专家胡忠教授主持研发。2004年7月心脉隆注射液获得国家食品药品监督管理局颁发的药品《新药证书》；2006年8月获得《药品注册批件》；2007年获药品GMP证书之后产品正式投放市场，并按国家药监局的要求进行了大量的标准提升研究工作，于2009年11月获得国家药典委员会转正标准。主要成分为复合核苷碱基、结合氨基酸，并建立了相应的含量检测项目。近几年，企业开展了大量外协合作项目，对心脉隆注射液物质成分进行研究，标准修订提高工作也在筹划中，保证该药品的安全、有效、可控，任重道远。

〔1〕戴云，曾茗，项朋志.蜚蠊的药用价值〔J〕.中药材，2005，28（9）：848-850.

〔2〕肖培云，杨永寿，李龙星，等.美洲大蠊药材中总糖的含量的测定研究〔J〕.时珍国医国药，2011，22（9）：2077-2079.

〔3〕张利，王梅.心脉隆注射液质量标准中若干问题的研究〔J〕.大理医学院学报，2000，9（3）：7-8.

〔4〕周云桂，吴建新.“心脉龙注射液”预防家兔肾上腺素性肺水肿的实验研究〔J〕.中国病理生理杂志，1995，11（3）：233.

〔5〕严奉祥，李树楠，杜一明，等.心脉龙对离体大鼠心脏的强心和增加冠脉流量的作用〔J〕.大理医学院学报，1992，1（1）：1-3.

〔6〕唐晓鸿.心脉隆注射液药理作用和治疗心力衰竭临床研究进展〔J〕.中国新药杂志，2008，17（6）：461-464.

〔7〕赵志勇，齐帜，崔秀娥，等.心脉隆注射液治疗慢性心力衰竭的临床研究〔J〕.武警医学院学报，2010，19（2）：120-122.

〔8〕杨永寿，肖培云，刘光明.蜚蠊药材质量控制方法研究〔J〕.时珍国医国药，2008，19（8）：1808-1809.

〔9〕国家药品监督管理局.国药管注〔2000〕348号：关于印发《中药注射剂指纹图谱的技术要求（暂行）》的通知〔S〕.2000.

〔10〕曹进，饶毅，沈群，等.中药注射剂指纹图谱分析〔J〕.世界科学技术（中药现代化），2001，3（4）：20-25.

〔11〕焦春香，张成桂，刘光明，等.心脉隆注射液HPLC指纹图谱建立方法的研究〔J〕.中成药，2011，10（33）：1648-1652.

〔12〕屠鹏飞.高效液相色谱法制定中药材和中药注射剂特征指纹图谱的探讨〔J〕.中成药，2000，22（7）：516.

Determination of Three Components in XML Injection by HPLC

Shao Weizai，Duan Zhishang，Wan Desheng，Que Yuling，Zhou Yongbin
（Research and Development Department，Yunnan Tengyao Pharmaceutical Co.，Ltd.，Tengchong，Yunnan 679100，China）

Objective:To develop a method for determination of uracil，hypoxanthine and inosine of XML injection.Methods:HPLC method was adopted in the determination of three components in XML injection.The analysis was performed on an Agilent C18column with the mobile phase consisting of 0.05 mol/L sodium acetate buffer solution（A）（pH=5.0），methanol and 0.05 mol/L sodium citrate butter mixed solution（80∶20）（B）（pH=6.5）by gradient elution at a flow rate of 0.5 mL/min.The detection wavelength was set at 254 nm and the column temperature was 30℃.Results:The linear ranges were 0.038 to 2.404 μg（r=0.999 97）for uracil，0.055 to 3.524 μg（r=0.999 94）for hypoxanthine and 0.089 to 5.716 μg（r=0.999 92）for inosine.The average recoveries（n=9）of three components were 99.30%for uracil，RSD=1.22%；99.39%for hypoxanthine，RSD=0.91%；and 99.61%for inosine，RSD=0.93%.Conclusion:This method is simple，convenient and accurate，which is suitable for the quantitative analysis of uracil，hypoxanthine and inosine in the XML injection.

XML injection；uracil；hypoxanthine；inosine

R917

A

2096-2266（2016）10-0014-04

（责任编辑李杨）

2015-07-06

2015-10-13

邵维在，工程师，主要从事新产品研发、产品工艺优化、中药质量标准研究.