24种白族惯用植物β-羟高铁血红素形成抑制活性

单　华，刘子琦，陈颖志，张盼盼，陈　浩，姜　北*

（1.大理大学药物研究所，云南大理671000；2.大理大学药学与化学学院，云南大理671000）

24种白族惯用植物β-羟高铁血红素形成抑制活性

单华1，2，刘子琦1，2，陈颖志1，2，张盼盼1，2，陈浩1，2，姜北1，2*

（1.大理大学药物研究所，云南大理671000；2.大理大学药学与化学学院，云南大理671000）

目的：研究24种白族惯用植物药的β-羟高铁血红素形成抑制活性，为从天然产物中寻找新型抗疟药物提供实验依据。方法：植物样品依次用75%乙醇和蒸馏水回流提取，提取物经冷冻干燥后，采用β-羟高铁血红素形成抑制实验进行活性测试，以IC50值评价其潜在的抗疟活性效果。结果：在供试的24种植物样品中，滇紫草水提物具有一定的β-羟高铁血红素形成抑制活性，IC50值为（1 254.1±3.9）μg/mL；鞭打绣球、天南星、滇橄榄3种植物水提物也有微弱的β-羟高铁血红素形成抑制活性，IC50值均大于1 388.9 μg/mL。结论：滇紫草、鞭打绣球、天南星、滇橄榄4种植物具有不同程度的β-羟高铁血红素形成抑制活性，值得进一步深入研究。

白族；惯用植物药；粗提物；抗疟活性；β-羟高铁血红素形成抑制实验

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.001

疟疾（Malaria）是通过雌性按蚊叮咬或输入带疟原虫者血液导致疟原虫寄生于人体而引起的虫媒传染病，其与艾滋病、结核病并称为世界最严重的三大传染病〔1-2〕。目前，疟疾是全球最为流行的寄生虫病之一，严重威胁患者的生命安全。全球有108个国家和地区流行疟疾，约33亿人受威胁，每年发病人数达3～4亿，平均年死亡人数近百万〔3〕。在我国，疟疾曾流行于80%（甚至80%以上）的地区〔4〕。近年来，经过不懈的努力，我国的预防和治疗疟疾工作取得了很大成效，已基本控制了该疾病的大规模流行，但在一些较偏远的地区，如云南、海南、安徽等地疟疾疫情仍时有发生，其中云南因毗邻疟害严重的东南亚各国而成为我国疟疾发病率最高的地区，防疟形势异常严峻。

我国传统方法治疗疟疾主要有中草药法和针灸疗法。在西方国家，金鸡纳曾是治疗疟疾最主要的药物，但因长期使用疗效下降而逐渐被淘汰。20世纪70年代以来，青蒿素成为治疗疟疾最有效的药物〔5〕，然而由于疟原虫对长期使用的药物会逐步产生抗药性，靠单一种类抗疟药物控制疟疾前景不容乐观，因此，新一代抗疟药物研发刻不容缓。云南药用植物资源丰富、少数民族众多，长期传承形成了丰富多彩的民族医药文化。大理为白族主要聚居地，以白族惯用植物药为基础探寻新型抗疟药物具有较好的基础条件。

β-羟高铁血红素形成抑制实验主要以血红素为红内期抗疟药物的作用靶点，通过模拟阻止疟原虫把有毒血红素转化成一种不被溶解和吸收的无毒复合物（疟色素）来达到评估样品的抗疟疾效果〔6-8〕。本实验以大理州境内24种白族惯用植物药为研究对象，采用β-羟高铁血红素形成抑制实验评价抗疟活性〔6，9〕，为从云南丰富的药物资源中寻找新型抗疟先导成分提供了思路。

1　材料与方法

1.1植物样品供试的24种白族惯用植物参照相关白族医药文献记录确定〔10〕，植物样品于2014年采自大理州境内，由大理大学药学与化学学院生药学教研室张德全副教授鉴定。

1.2试剂及仪器

1.2.1试剂氯高铁血红素、氯喹二磷酸盐、HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸，美国Sigma公司）；乙酸钠（国药集团化学试剂有限公司）；吡啶、冰醋酸（上海申博化工有限公司）；氢氧化钠（重庆川东化工集团有限公司）；盐酸（西陇化工股份有限公司）；DMSO（二甲基亚砜，天津化学试剂有限公司），以上试剂均为分析纯。

1.2.2仪器COOL SAFE 95-15冷冻干燥机（Gene Company Limited）；MCO-18AIC CO2培养箱（日本三洋公司）；多功能酶标仪（美国Bio Tek仪器公司）；AL204电子天平（梅特勒－托利多仪器有限公司）；RE-5205旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.3实验方法

1.3.1供试样品的制备植物样品干燥后称取约70 g粉碎，先后用75%乙醇和水回流，各提取3次，每次500 mL溶剂，合并提取液，减压浓缩后冷冻干燥成粉末，密封保存，得相应醇提物与水提物。按公式［冻干粉重量（g）/提取植物样品干重（g）］× 100%计算提取率。

精确称取植物粗提物5 mg，溶解在1 mL蒸馏水中，并用蒸馏水按比例（1∶4）稀释成梯度浓度溶液，作为供试溶液备用。最终供试样品的梯度浓度为1 388.9、277.8、55.6、11.1、2.2 μg/mL。

1.3.2羟高铁血红素标准曲线的制备分别移取10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μL氯高铁血红素储备液（氯高铁血红素溶解于DMSO中，浓度为0.2 mmol/L）置96孔板中，一式3份。之后每孔加入30%（v/v）的吡啶-HEPES（20 mmol/L，pH 7.5）溶液至250 μL（氯高铁血红素在碱性条件下Cl-被OH-置换，生成羟高铁血红素），于405 nm波长处测定吸收值；每个浓度平行重复3次。以羟高铁血红素浓度（C）为横坐标，各浓度平均吸光度值（A）为纵坐标作标准曲线，得回归方程A=61.545C+0.366 2（r= 0.993 4）。结果表明羟高铁血红素的浓度和吸光度之间有良好的线性关系。见图1。

1.3.3β-羟高铁血红素形成抑制实验以氯喹二磷酸盐作为阳性对照、蒸馏水作为阴性对照，将50 μL不同浓度的供试品溶液、50 μL氯高铁血红素储备液、80 μL醋酸盐缓冲液依次加入96孔板中，于50℃培养箱中孵育5 h，取出待室温后于每孔加入100 μL 30%（v/v）的吡啶-HEPES（20 mmol/L，pH 7.5）溶液，室温放置过夜后于每孔中移取50 μL上清液至另一96孔板，加200 μL吡啶-HEPES溶液进行稀释，于405 nm波长处测定吸收值。由羟高铁血红素标准曲线和测定的吸光度值得出未反应羟高铁血红素的浓度，若供试样品在最高浓度下平均抑制率小于5%，则视为样品对β-羟高铁血红素形成无抑制作用；若平均抑制率大于5%，则认为样品对β-羟高铁血红素形成有一定的抑制作用（即IC50＞1 388.9 μg/mL）；当平均抑制率大于50%，按公式［未反应羟高铁血红素的浓度/初始配制浓度］×100%，计算供试样品相应的对β-羟高铁血红素形成的抑制浓度（以IC50表示）〔11-14〕。

图1　羟高铁血红素的标准曲线

2　结果与分析

2.124种植物的名称及粗提率24种采自大理州境内的白族惯用植物样品醇提法提取率为8.29%～45.90%，水提法提取率为3.20%～20.70%。见表1。

2.2供试样品β-羟高铁血红素形成抑制实验结果供试白族惯用植物样品β-羟高铁血红素形成抑制实验结果见表1。结果显示，鞭打绣球、天南星、滇橄榄3种植物的水提物均具有不同程度的β-羟高铁血红素形成抑制活性，IC50值均大于1 388.9 μg/mL。滇紫草水提物活性较好，IC50为（1 254.1±3.9）μg/mL。采用SPSS17.0统计学软件对滇紫草和阳性对照氯喹二磷酸盐进行两独立样本均数t检验，P＜0.001为差异有统计学意义。

表1　24种白族惯用植物药样品β-羟高铁血红素形成抑制活性

表1　24种白族惯用植物药样品β-羟高铁血红素形成抑制活性

植物氯喹二磷酸盐云南红景天车前草植物拉丁名称Chloroquine diphosphate Pinus yunnanensis供试部位—粗提物提取率/—%—全株｛全株｛猪殃殃荷莲豆草翠雀花粗茎秦艽猪毛菜Plantago depressa Galium aparine var. echinospermum Drymaria cordata地上｛全株｛乙醇水乙醇水乙醇水乙醇Delphinium tatsienense Gentiana crassicaulis Salsola collina全株｛全株｛水—水乙全株｛醇水乙银杏鞭打绣球缬草Ginkgo biloba Hemiphragma heterophyllum Valeriana officinalis地上｛全株｛全株｛醇水—水—水乙天南星全株｛醇水乙透骨草全株｛醇水乙叶上花地上｛醇—乙密蒙花地上｛醇水乙合欢地上｛醇—乙青刺尖Arisaema erubescens Gaultherialeucocarpa var.yunnanensis Helwingia chinensis Buddleja officinalis Albizia julibrissin Prinsepia utilis 地上｛醇水乙青刺尖Prinsepia utilis 果实｛醇水乙滇橄榄全株｛醇—乙伸筋草全株｛小白薇Phyllanthus emblica Lycopodium japonicum Tylophora yunnanensis 全株｛鸡肉参Incarvillea mairei 全株｛醇水—水—水—水11.80 7.12 10.20 6.60 22.10 9.00 21.50 5.86—7.70 45.90 17.60 12.10 7.52 15.40 3.52 14.40 5.59 23.30 3.40 35.20 20.70 40.60—15.50 4.60 12.90—19.30 7.10 17.50 3.20 8.61—14.60 5.10—6.50—4.40—5.80 IC50/（μg/mL）36.2±1.8*无活性无活性无活性无活性无活性无活性无活性无活性—无活性无活性无活性无活性无活性—无活性—＞1 388.9无活性无活性无活性＞1 388.9无活性—无活性无活性无活性—无活性无活性无活性无活性无活性—无活性＞1 388.9—无活性—无活性—无活性

续表1

3　讨论

随着青蒿素的问世和人工合成抗疟药物的不断发展使得疟疾的危害暂时得到有效控制，但疟疾的治疗仍是一个世界级难题，研发新的安全有效的抗疟药物仍迫在眉睫。虽然抗疟药物筛选采用体外连续培养恶性疟原虫株和建立伯氏疟原虫鼠疟模型更加可靠，但实验成本高、操作复杂，无法实现高通量筛选，因此对于样本量较大的活性检测选择一种简便高效的方法十分重要。本实验采用一种间接的方法测定样品的抗疟活性，作用靶点为疟原虫的红内期，其他成分如9-表奎宁和8-羟基喹啉等非活性物质以及红外期抗疟药伯氨喹等均不干扰此聚合反应〔15〕，具有操作简便、快速、微量等高通量筛选实验的特性，非常适合多样品快速检测分析。同时，本研究充分利用了民族植物药治疗疾病的传统优势，有针对性地对24种采自云南大理地区的白族惯用植物进行了抗疟活性初探，所选的供试药用植物涵盖21个科24个属，科属分类跨度较大，有一定的代表性。

实验测定中考虑到供试样品来源广泛，为防止出现因浓度范围小而漏筛的情况，实验中样品浓度梯度设定跨度较大，按参考文献〔10-11〕的方法进行预实验后，最终采用样品浓度5倍稀释梯度作为实验测定范围。此外，从实验筛选结果看，鞭打绣球、天南星、滇橄榄3种植物的水提物均具有不同程度的β-羟高铁血红素形成抑制活性，虽与阳性对照物等活性显著的单体成分相比抗疟活性有较大差距，但鉴于供试样品为粗提物，不排除其中可能会含有活性较好的单体成分或先导化合物，筛选结果可为下一步深入研究指明方向，因此具有一定的学术意义。

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Study on β-hematin Formation Inhibition Activities of 24 Common-used Herbal Medicines of Bai Nationality

Shan Hua1，2，Liu Ziqi1，2，Chen Yingzhi1，2，Zhang Panpan1，2，Chen Hao1，2，Jiang Bei1，2*
（1.Institute of Materia Medica of Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective:To study β-hematin formation inhibition activity of 24 herbal medicines often used by Bai nationality and to provide the experimental evidence for finding new effective antimalarial medicines from natural products.Methods:Plant materials were extracted with 75%ethanol and distilled water using the reflux method.After the extract solutions were combined and concentrated under reduced pressure，the resulting residue was completely dried by lyophilization.The dried samples were screened for antimalarial activity by using β-hematin formation inhibition assay.Bioactivity results were evaluated by IC50values.Results:Among the 24 plant samples，water extracts of Onosma paniculatum showed the best activity to inhibit β-hematin formation with the IC50value of（1 254.1±3.9）μg/mL.Water extracts of Hemiphragma heterophyllum，Arisaema erubescens and Phyllanthus emblica had weak activity to inhibit β-hematin formation with the IC50values over 1 388.9 μg/mL.Conclusion:O.paniculatum，H.heterophyllum，A. erubescens and P.emblica reveal potential antimalarial activity and deserve further study in the future.

Bai nationality；herbal medicines；crude extract；antimalaria；β-hematin formation inhibition assay

R978.61

A

2096-2266（2016）10-0001-04

（责任编辑李杨）

国家自然科学基金资助项目（81460532）

2016-04-18

2016-06-06

单华，硕士研究生，主要从事天然药物药理学研究. *通信作者：姜北，教授，博士.