云南松松塔二萜类成分的指纹图谱研究

吴道勋，刘　璐，刘　熙，马　娇，王　莹，张海珠*

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理671000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理671000；3.滇西应用技术大学，云南大理671000）

云南松松塔二萜类成分的指纹图谱研究

吴道勋1，2，刘璐1，刘熙1，2，马娇3，王莹1，2，张海珠1，2*

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理671000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理671000；3.滇西应用技术大学，云南大理671000）

目的：通过比较不同产地云南松松塔中二萜类成分的HPLC指纹图谱，分析不同采样地点的云南松松塔是否具有差异性。方法：采集云南省不同产地的云南松松塔样品20份，通过HPLC法建立云南松松塔中二萜类化合物的指纹图谱，对其指纹图谱中的共有峰进行标记。结果：确立了云南松松塔二萜类化合物色谱指纹图谱的高效液相分析条件，确定11个共有峰。不同产地的云南松松塔的二萜类化合物色谱指纹图谱存在一定差异。结论：采用HPLC法，制定云南松松塔的二萜类化合物色谱指纹图谱，其二萜类成分得到较好的分离度，方法稳定、准确度高、重现性好，为云南松松塔质量标准研究奠定基础。

云南松；松塔；二萜类化合物；HPLC法

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.005

松科松属植物全世界约100种，分布于北半球至北极圈。全国常见的松树约18种，主要分布在云南的云南松Pinus yunnanensis Franch.资源十分丰富。松塔是松科植物的球果，《本草纲目》记载了松塔具有祛痰、止咳平喘、祛风、润肠、安神等功效。松塔含有多种具有药理活性的成分，作为药物可以治疗风湿病，还具有抗感染、抗菌、抗病毒等功效。但是，这一丰富的资源并没有得到重视和利用，每年至少有上万吨的云南松松塔废弃于山林中或被农民当作燃料烧掉。

国内大量学者对松塔进行了化学成分的研究，其中周萍等研究了其木质素-糖复合物中的含糖量〔1〕；刘光明等对其作了抗HIV活性成分的研究〔2〕；张志琴等研究了其莽草酸的提取工艺〔3〕；李寅珊等对其化学成分进行了研究〔4〕；吕小满等对其化学成分及生物活性的研究展开了一次综合性的论述〔5〕；经研究还发现松塔的抗癌活性成分具有高效、低毒的特点〔6-7〕。由此可见，松塔的化学成分及其药理活性，具有很好的研究潜力与研究价值，可为其今后的药用开发利用奠定基础。

李寅珊等从云南松松塔中分离出二萜类化合物〔4，8-10〕。二萜类化合物具有多种药理活性，如∶抗肿瘤〔11〕、镇痛〔12〕、抗血小板凝结〔13〕等。上述研究对松塔中的化学成分做了大量基础性的探索工作，但国内外均未见与本项目所涉及的对云南松松塔中二萜类化合物的指纹图谱的相关研究报道。因此，本实验采用灵敏度和准确度高的HPLC法，建立其二萜类成分的色谱指纹图谱，标记其共有峰，并计算相似度，以多指标成分替代单一指标成分，全面控制其质量，为其质量标准的建立及药用资源的开发利用奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象采于云南省各地（大理、昭通、曲靖等地）云南松松塔20份。标本由大理大学段宝忠副教授鉴定为云南松松塔（P.yunnanensis Franch.），粉碎，过60目筛，置于阴暗处备用。

1.1.2实验仪器与试剂Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；AL104电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪有限公司）；旋转蒸发仪RE-3000（上海亚荣生化仪器厂）。流动相甲醇（色谱纯，Merck公司）；其他试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1色谱条件Phenomenex Gemini C18（250 mm ×4.60 mm，5 μm）色谱柱；甲醇-0.5%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱。见表1。流速1 mL/min；柱温30℃；检测波长241 nm，进样量10 μL〔4，9，14-15〕。

表1　梯度洗脱

1.2.2供试品溶液的制备称取松塔粉末2.0 g，置50 mL圆底烧瓶中，加入30 mL无水丙酮浸泡提取12 h，过滤，减压浓缩，回收丙酮，得浸膏，用适量甲醇溶解，置于25 mL量瓶中，并用甲醇定容至刻度，即得供试品液。

1.2.3精密度试验取同一供试品液，连续进样6次，记录结果。

1.2.4稳定性试验取同一供试品液，每隔4 h进样1次，连续进样6次，记录结果。

1.2.5重复性试验取同批样品6份，按照“1.2.2”供试品溶液制备方法进行制备，测定，记录结果。

1.2.6样品来源见表2。

2　结果与分析

2.1精密度试验结果取同一供试品液，连续进样6次。结果表明，11个共有峰的相对保留时间的RSD为1.57%，精密度良好。

2.2稳定性试验结果取同一供试品液，分别在0、4、8、12、16、20 h进样6次。结果表明，11个共有峰的相对保留时间的RSD均小于3%，相对峰面积的RSD为2.36%，表明20 h内供试液溶液稳定性较好。

表2　样品来源

2.3重复性试验结果取同批样品6份，按照“1.2.2”供试品溶液制备方法进行操作，测定。11个共有峰的相对保留时间的RSD均小于3%，相对峰面积的RSD为2.76%，表明此方法重现性良好。

2.4指纹图谱的建立及分析

2.4.1共有峰的标定根据20批样品测定所得结果表明∶云南松松塔丙酮冷浸提取共标定11个共有峰作为特征峰构成指纹图谱。共有峰及相对保留时间结果见表3～4；指纹图谱见图1。

2.4.2非共有峰面积比值统计计算各样品非共有峰与总峰面积比值，结果显示，非共有峰面积占总峰面积百分比均小于5%，符合指纹图谱的技术要求。

2.4.3各地云南松松塔二萜类化合物指纹图谱相似度20批样品的图谱相似度分别为∶0.965、0.927、0.965、0.965、0.965、0.873、0.873、0.927、0.965、0.927、0.927、0.977、0.977、0.906、0.873、0.873、0.949、0.949、0.855、0.704。

表3　不同样品共有指纹峰相对峰面积

表4　不同样品共有指纹峰相对保留时间

续表4

图1　云南松松塔HPLC指纹图谱

3　讨论

3.1提取方法查阅文献得出，在提取二萜类化合物时，多采用热回流方法，此方法操作时间长，实验操作繁琐，溶剂损失量大，容易造成提取物的损失〔16-18〕。本实验采用丙酮冷浸法，提取二萜类化合物，提取效率高，操作简便，适宜推广〔14〕。

3.2流动相的选择文献中〔14，16-17，19〕，流动相多采用乙腈-冰醋酸、甲醇-冰醋酸、乙腈-磷酸，正己烷-醋酸乙酯-乙腈等系统，但乙腈价格较昂贵，本实验中将流动相优化以甲醇-0.5%磷酸水溶液梯度洗脱，分离效果良好，且价格低廉，实用性强。

综上所述，对不同采集地点的云南松松塔中二萜类化合物的指纹图谱的研究得出，不同产地的云南松松塔的指纹图谱有一定差异，同一采集地点的大理市斜阳峰的也存在一点差异，可能是由于生长环境、气候因素、采集时间等原因造成。因此，今后应进一步加强对云南松的研究观测，为其今后的药用价值的开发利用奠定基础。

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Study on Fingerprints of Diterpenoid Compound in the Pine Cone of Pinus yunnanensis Franch

Wu Daoxun1，2，Liu Lu1，Liu Xi1，2，Ma Jiao3，Wang Ying1，2，Zhang Haizhu1，2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D，Dali，Yunnan 671000，China；3.West Yunnan University of Applied Sciences，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective:To compare the HPLC fingerprints of diterpenoid compound in pine cones of Pinus yunnanensis Franch from different habitats，and to analyze the differences among the pine cones from different sampling sites.Methods:20 pine cone samples of Pinus yunnanensis Franch from different places in Yunnan were collected and the fingerprints of diterpenoid compound in the pine cone of Pinus yunnanensis Franch were established through HPLC method with the marking the common peak.Results:High performance liquid chromatography analysis condition of the fingerprints of diterpenoid compound in pine cones of Pinus yunnanensis Franch were established and 11 common peaks were confirmed.There are differences among the chromatographic fingerprints of diterpenoid compound in pine cones of Pinus yunnanensis Franch from different places.Conclusion:HPLC method is used to develop chromatographic fingerprint of diterpenoid compound in pine cone of Pinus yunnanensis Franch with good resolution of diterpenoid，which lays the quality specification study foundation of pine cone of Pinus yunnanensis with a stable，accurate and reproducible method.

Pinus yunnanensis Franch；pine cone；diterpenoid；HPLC method

R284

A

2096-2266（2016）10-0018-05

（责任编辑李杨）

国家自然科学基金资助项目（81260632；81450053）；云南省教育厅科学研究基金资助项目（2014Z132）

2015-08-23

2016-03-08

吴道勋，硕士研究生，主要从事天然药物质量控制研究.

*通信作者：张海珠，副教授.