真姬菇杂交新菌株515的抗逆性分析*

陈文星，单书凯，李哲，叶志彬，赖春芬，艾柳英，张燎原，孙淑静，胡开辉

（福建农林大学生命科学学院，福建福州350002）

〈育种与驯化〉

真姬菇杂交新菌株515的抗逆性分析*

陈文星，单书凯，李哲，叶志彬，赖春芬，艾柳英，张燎原，孙淑静**，胡开辉

（福建农林大学生命科学学院，福建福州350002）

通过测定不同营养限制条件下真姬菇（Hypsizygus marmoreus）两个品种白玉菇、灰蟹菇及其单核菌株杂交选育的新菌株515的菌丝生长速度及观察形态特征，明确杂交菌株515的抗逆性。结果表明，灰蟹菇对各种营养胁迫具有较好的抗逆性。新菌株515对低氮条件适应性较差，高无机盐抑制了其菌丝的生长；低氮加吐温后，其菌丝生长速度明显高于灰蟹菇，菌丝形态洁白浓密、边缘整齐，提高了菌株515对氮源胁迫的抗性；但在低碳条件下其菌丝生长速度较快，与菌株灰蟹菇相比有显著差异，与菌株白玉菇相比无显著差异，说明菌株515对碳源胁迫抵抗力较强。针对真姬菇栽培原料以碳源为主，说明该菌株具有良好的生产应用价值。

真姬菇；杂交菌株；菌丝形态；菌丝生长速度；抗逆性分析

真姬菇（Hypsizygus marmoreus）又名玉蕈、蟹味菇，属于担子菌亚门（Basidiomycotina）层菌纲（Hymenomycetes）伞菌目（Agaricales）白蘑科（Tricholomataceae）离褶菌族（Lyophyllum）玉蕈属（Hypsizygus）［1］。真姬菇含有丰富的蛋白质、氨基酸和维生素，是一种高蛋白、低脂肪、低热量的保健食品，具有较高的药用价值［2］。经常食用具有提高人体免疫力，预防衰老，延长寿命的功效［3］。是我国工厂化推广栽培的重要食用菌品种之一，主要在上海、山西、河北、河南、山东及福建等省市推广栽培［4］。目前栽培的有纯白色和浅灰色2个品种，白色的品种称为“白玉菇”，灰色品种称为“灰蟹菇”。白玉菇的菌丝生长旺盛，发菌较快，是市场需求的主要菌种，但是抗逆性较弱，成熟的老菌丝还会分泌黄色液滴，形成菌皮［5］。而灰蟹菇的菌丝生长旺盛，发菌较快，抗杂菌能力强，且老菌丝不分泌黄色液滴，不形成菌皮，能产生节孢子及厚垣孢子［6］。

斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）在生产过程中存在许多问题，如生产周期较长（120 d～150 d）［7］，菌体生长速度较慢，原料利用率低，抑制杂菌能力较差，易染菌，而且易受栽培环境和栽培条件的影响，在生产中受到一定的限制。从而增加了生产成本，影响了生产企业的效益［8-9］，与其它工厂化食用菌生产品种相比具有一定的劣势。因此，培育生产周期短、抗逆性强的真姬菇优良新品种，将会极大地促进真姬菇的工业化生产，降低真姬菇栽培成本，同时提高品种的抗逆性，解决真姬菇工厂化栽培的关键技术问题，这对促进食用菌产业向着工厂化方向稳步快速发展有着重要意义。

本研究利用抗逆性强的灰蟹菇和备受市场欢迎的白玉菇作为亲本，通过原生质体制备的单核菌株杂交选育的新菌株515为材料，通过测定在不同营养限制条件下菌丝生长速度、菌丝形态，与菌株灰蟹菇和白玉菇比较，了解新品种真姬菇515的抗逆性，为该菌株的推广生产应用奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株

白玉菇由福建省龙岩泰和强农业发展有限公司提供；灰蟹菇从福州山姆会员店购买分离获得；真姬菇515为本实验室选育菌株，以下简称515。

1.1.2供试培养基

PDA加富培养基（1 000 mL）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、酵母粉3 g、蛋白胨3 g、KH2PO41.5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、琼脂20 g，pH自然。

低氮培养基（1 000 mL）：葡萄糖10 g、硝酸铵0.2 g、KH2PO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、CaCl20.01 g、VB10.001 g、0.02 mol·L-1pH4.4醋酸钠缓冲液100 mL。

吐温20培养基（1 000 mL）：在低氮培养基中加1.0 g吐温20。

高氮低碳培养基（1 000 mL）：葡萄糖0.5 g、硝酸铵5 g、KH2PO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、CaCl20.01 g、VB10.001 g、0.02 mol·L-1pH4.4醋酸钠缓冲液100 mL。

高无机盐培养基（1 000 mL）：葡萄糖10 g、硝酸铵0.2 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 1 g、CaCl20.1 g、VB10.001 g、0.02 mol·L-1pH4.4醋酸钠缓冲液100 mL。

低氮低碳低无机盐培养基（1 000 mL）：葡萄糖0.5 g、硝酸铵0.2 g、KH2PO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、CaCl20.01 g、VB10.001 g、0.02 mol·L-1pH4.4醋酸钠缓冲液100 mL。

完全培养基（1 000 mL）：葡萄糖15.0 g、蛋白胨2.0 g、酵母粉2.0 g、K2HPO41.0 g、KH2PO40.46 g、MgSO40.5 g和琼脂20.0 g。

1.2方法

1.2.1菌株培养

将2个菌株（白玉菇、灰蟹菇）和杂交菌株（515）分别接种到PDA加富培养基中，然后置于24℃的恒温培养箱中培养10 d～15 d。

1.2.2菌株生长速度测定

将活化好的白玉菇、灰蟹菇、真姬菇新品种515分别接种于低氮培养基、吐温20培养基、高氮低碳培养基、高无机盐培养基、低氮低碳低无机盐培养基，每种培养基的平板接种菌块（直径1.5 cm）做3个重复，置于24℃恒温培养箱中培养，从第3天开始每隔2 d测其菌丝生长速度，并观察其形态特征。

2　结果

2.1低氮培养基中菌丝生长速度及形态特征

菌株515在低氮条件下，第11天灰蟹菇生长速度最快，直径为7.62 cm；白玉菇次之；菌株515的生长速度最慢，直径为5.07 cm，与2个菌株有显著差异（P＜0.05），见图1。

由图1可见，菌株515在相同的低氮培养基中，与白玉菇、灰蟹菇菌丝形态特征差异较大。白玉菇和灰蟹菇菌丝非常浓密、洁白，边缘十分整齐，气生菌丝较强；而真姬菇515菌株的菌丝浓密度较低，菌丝较弱，边缘不整齐，气生菌丝也十分虚弱，说明该新菌株对氮源胁迫适应性较差。

2.2吐温20培养基中菌丝生长速度及形态特征

在加有吐温20的低氮培养基中，第11天白玉菇生长速度最快，直径为5.61 cm；菌株515次之；而灰蟹菇的生长速度最慢。菌株515与两菌株相比有显著差异（P＜0.05），见图2。

图1　低氮培养基下515、白玉菇、灰蟹菇菌丝生长直径（左）和形态（右）Fig.1Growth diameter of Hypsizygus marmoreus mycelia on low nitrogen medium（left）and morphological characteristics（right）

由图2可见，菌株515在相同的吐温20培养基上与白玉菇、灰蟹菇菌丝形态特征无明显差异，菌丝都非常浓密、洁白，边缘较为整齐，气生菌丝较强。但相较于2个菌株，真姬菇515的菌丝浓密度更为浓密，气生菌丝更强，说明该新菌株提高了对氮源胁迫的抗性。

近些日子，杨力生与老婆的感情越来越生疏了。他的心就像冬天河里的水一样渐渐凝滞，冻结起来，而每逢想起老婆那些惹他生气的事，他心里就像着了火一样难以平静……

图2　低氮加吐温20培养基下515、白玉菇、灰蟹菇菌丝生长直径（左）和形态（右）Fig.2Growth diameter of Hypsizygus marmoreus mycelia on tween 20 medium（left）and morphological characteristics（right）

2.3高氮低碳培养基中菌丝生长速度及形态特征

高氮低碳培养基中菌丝生长速度及形态特征见图3。

由图3可见，在高氮低碳的培养基中，第11天菌株515与白玉菇、灰蟹菇菌丝形态特征无明显差别，菌丝浓密度很低，气生菌丝十分虚弱，边缘较整齐。但灰蟹菇生长速度最快，直径为6.55 cm；白玉菇生长速度最慢；而菌株515的生长速度比灰蟹菇稍慢，直径为6.47 cm，与灰蟹菇相比无明显差异（P＞0.05），但与白玉菇相比有明显差异（P＜0.05），说明新菌株515对碳源胁迫抵抗力较强。

2.4高无机盐培养基中菌丝生长速度及形态特征

在高无机盐培养基中，第11天菌株515的生长速度最慢，直径为4.53 cm；灰蟹菇生长速度最快，直径为6.87 cm；白玉菇次之。菌株515与2个菌株间有显著差异（P＜0.05），见图4。

由图4可见，菌株515在相同的高无机盐培养基中，与白玉菇、灰蟹菇菌丝形态特征差异较小，白玉菇和灰蟹菇菌丝浓密度较低，菌丝很强，气生菌丝强，边缘整齐。而菌株515的菌丝虽然浓密，但边缘不整齐，生长速度最慢，说明高无机盐抑制了菌丝的生长。

图3　高氮低碳培养基下515、白玉菇、灰蟹菇菌丝生长直径（左）和形态（右）Fig.3Growth Diameter of Hypsizygus marmoreus mycelia on high nitrogen and low carbon medium（left）and morphological characteristics（right）

图4　高无机盐培养基下515、白玉菇、灰蟹菇菌丝生长直径（左）和形态（右）Fig.4Growth diameter of Hypsizygus marmoreus mycelia on high inorganic salt medium（left）and morphological characteristics（right）

2.5低氮低碳低无机盐培养基中菌丝生长速度及形态特征

由图5可见，在低氮低碳低无机盐的培养基中，第11天菌株515与白玉菇、灰蟹菇菌丝形态特征差异较小：白玉菇、灰蟹菇菌丝浓密度较高，菌丝较强，气生菌丝较强，边缘较整齐；而菌株515的菌丝浓密度更高，菌丝更强，气生菌丝也比灰蟹菇更强，边缘更加整齐。在菌株生长速度方面，灰蟹菇生长速度最快，直径为6.39 cm；菌株515次之；白玉菇生长速度最慢，直径为5.62 cm。菌株515与灰蟹菇相比有显著差异（P＜0.05），与白玉菇相比无显著差异（P＞0.05）。

图5　低氮低碳低无机盐培养基下515、白玉菇、灰蟹菇菌丝生长直径（左）和形态（右）Fig.5Growth diameter of Hypsizygus marmoreus mycelia on low nitrogen，carbon and inorganic salt medium（left）and morphological characteristics（right）

2.6完全培养基中菌丝生长速度及形态特征

在完全培养基中，第11天灰蟹菇的生长速度最慢，直径为5.19 cm；白玉菇生长速度最快，直径为6.27 cm；菌株515次之，与2个菌株有显著差异（P＜0.05），见图6。

由图6可见，菌株515在相同的完全培养基中，与白玉菇、灰蟹菇菌丝形态有明显差异。白玉菇菌丝浓密度较高，菌丝较强，气生菌丝较强，边缘较整齐；灰蟹菇和白玉菇差异较小，但边缘不整齐；菌株515的菌丝浓密度高，菌丝强，气生菌丝强，边缘比灰蟹菇整齐，但中间部分菌丝生长较弱。

图6　完全培养基下515、白玉菇、灰蟹菇菌丝生长直径（左）和形态（右）Fig.6Growth Diameter of Hypsizygus marmoreus mycelia on complete nutrition medium（left）and morphological characteristics（right）

3　讨论

菌株515在不同的营养条件下均能生长，具有较好的抗逆性。氮源是合成细胞壁、核酸等重要物质的原料，氮素浓度会影响食用菌生长发育［10］，低氮条件会抑制细胞分泌大量蛋白酶，从而形成不利于菌丝体生长环境。从试验结果可以看出，在低氮培养基条件下菌株515不管是菌丝生长速度还是菌丝浓密度、菌丝强弱程度都比2个菌株差，说明菌株515对氮源胁迫适应性较差。吐温是一种表面活性剂，研究表明，表面活性剂可促进细菌和真菌的产酶，并具有延缓酶失活的作用［11］。在吐温20培养基条件下，菌株515的生长情况比白玉菇好，可能是因为适当浓度下吐温促进细胞分泌分解基质的相关酶，从而提高了菌株515对氮源胁迫的抗性。

碳素是构成食用菌细胞和代谢产物中碳架来源的营养物质，同时也是食用菌生命活动所需要的主要能量来源［12］，低碳环境将不利于食用菌生长。在高氮低碳培养基中，可以看出，菌株515与两菌株菌丝形态无明显差异，但菌株515菌丝生长速度比白玉菇快，具有显著差异，说明菌株515对碳源胁迫具有较好的抗性。

无机盐是食用菌生长发育不可缺少的营养物质，是构成细胞的成分，作为酶的组成部分，具有调节氮化还原电位和激活酶的作用。有的无机盐存在于细胞质中以维持细胞渗透压和调节pH值具有多方面的生理功能［12］。在高无机盐培养基中，菌株515菌丝生长速度非常慢，但菌丝浓密程度比亲本大，这可能是高无机盐环境下导致菌体形态及生理生化发生改变，从而抑制菌株515的菌丝生长。

在低氮低碳低无机盐培养基中，菌株515的菌丝生长速度虽然最慢，与灰蟹菇相比有显著差异（P＜0.05），但与白玉菇相比无显著差异（P＞0.05），且在菌丝形态生长上比两菌株好，说明在营养较苛刻的情况下，菌株515的抗逆性较好。

在完全培养基下，菌株515的菌丝生长较两菌株好，但中间部分的菌丝浓密度较低，原因有待进一步查明。

4　结论

新品种真姬菇515是由白玉菇和灰蟹菇的原生质体融合选育而来，综合了白玉菇和灰蟹菇的优良品质。真姬菇515的抗逆性在某些方面比亲本好，但在某些方面与亲本相比有些差距。真姬菇515是否适合工厂化生产还需要考虑其它因素，有待进一步进行试验研究。

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Stress Resistance Analysis on New Strain of Hypsizygus marmoreus by Hybridization

CHEN Wen-xing，SHAN Shu-kai，LI Zhe，YE Zhi-bin，LAI Chun-fen，AI Liu-ying，ZHANG Liao-yuan，SUN Shu-jing，HU Kai-hui
（College of Life Sciences，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China）

The stress resistance of new strain 515 of Hypsizygus marmoreus breeded by mating of monokaryotic mycelia by hyphal fusion was analyzed by the determination of mycelia growth rate and characteristics under different limited nutritional conditions.The results showed the gray of H.marmoreus for a variety of nutritional stress had good resistance，and the new strain 515 of H.marmoreus showed poor adaptability on low nitrogen conditions，and the high inorganic salt inhibited the growth of mycelia，and the rate of growth of mycelia significantly higher than the gray of H.marmoreus and the morphology of hyphae pure white and dense as well as regular of edge，that showed it improved the stress resistance of new strain 515 of H.marmoreus for nitrogen source stress on tween 20 medium.However，the new strain mycelia growth faster than two starting strain in low carbon condition and had significant difference with the gray of H.marmoreus and had not significant difference with the white of H.marmoreus that showed the new strain had good resistance for carbon source stress，and it showed the new strain 515 had good applicable value because of H.marmoreus cultivation raw material was given priority to carbon source.

Hypsizygus marmorens；hybrid strains；mycelia morphology；mycelia growth rate；stress resistance analysis

S646.9

A

1003-8310（2016）03-0017-06

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.03.004

*项目来源：福建省发改委农业五新工程项目（闽发改委投资［2012］931号）；福建省自然基金杰出青年项目（2014J06010）；福建农林大学校杰出青年人才项目（xjq201209）；国家自然基金青年项目（31201669）；教育部博士点基金（20103515120015）；福建省政府专项项目（K8114002A）；福建省食用菌产业重大研发平台（2014N2101）；福建省发改委生物产业技术专项（2011878）。

陈文星（1991-），男，在读硕士研究生，主要研究方向为食用真菌学。E-mail：799919670@qq.com

**通信作者：孙淑静（1978-），女，博士，副教授，主要从事食（药）用菌分子生物学、食用菌遗传学、食用菌遗传育种方面研究。E-mail：shjsun2004@126.com

2016-02-23