靶向CD123抗原嵌合受体T细胞治疗急性髓系白血病的研究

孙耀 张斌 陈虎

·综述·

靶向CD123抗原嵌合受体T细胞治疗急性髓系白血病的研究

孙耀 张斌 陈虎

急性髓系白血病（AML）是一种预后较差的血液系统恶性肿瘤，迫切需要新的治疗手段。随着嵌合抗原受体（CAR）T细胞（CAR-T）技术的发展并在B细胞肿瘤中取得显著疗效，人们把目光投入更多的实体瘤与血液肿瘤靶点中。CD123分子是CAR-T治疗AML的潜在靶点，抗CD123 CAR-T具有靶向清除白血病干细胞（LSCs）及原始细胞的能力。本研究总结了目前在靶向CD123 CAR-T治疗急性髓系白血病目前的研究进展。

白血病，急性； 抗原； 受体； 干细胞； 白细胞介素3受体α亚单位； T细胞

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是血液系统的一种恶性肿瘤，以克隆性增殖异常分化的恶性细胞浸润骨髓、血液及其他组织为特点［1-2］。大量研究表明AML起源于一群数量相对较小的干祖细胞，即白血病干细胞（leukemia stem cells，LSCs）。CD123是一种包含360氨基酸的糖蛋白，广泛地表达在白血病原始细胞和白血病干细胞表面，尤其是AML。目前已研发出几种靶向CD123的单克隆抗体类药物并正在进行临床前及临床试验，靶向CD123的抗原受体（chimeric antigen receptor-modifyin，CAR）T细胞（CAR-T）治疗也已完成临床前研究并显示出显著的抗瘤效应，目前处于Ⅰ期临床试验阶段。

一、AML治疗现状

自40多年前阿糖胞苷3 d，环磷酰胺7 d化疗方案取得成功后，AML不再是不治之症，但此后在AML治疗上没有突破性进展［3］。至今AML仍是一种威胁生命的恶性肿瘤，总生存率为70﹪，在60岁以下成人中治愈率为35～40﹪，而在60以上成人中治愈率仅为5﹪～15﹪［4-5］。对于诱导缓解失败的患者，5年生存率仅7﹪～12﹪［6］。对于复发难治AML最好的治疗办法仍然是异基因造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT），而其造成的移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）、感染等严重并发症也影响了患者的生存。

二、CD123是AML的治疗靶点

（一）CD123是白血病干细胞主要标志

随着对白血病发病机制的深入研究，发现在髓系白血病中存在一群保持自我更新分化能力的白血病细胞，即LSCs，其在白血病细胞中数量较少，主要呈静止状态［7］。LSCs在表面分子上以CD34+，CD38-，CD71-，HLA-DR-，CD90-，CD123-，CLL-1+，TIM3+等为特点［7-11］。

目前许多化疗药物治疗肿瘤的机制是杀灭分裂期细胞，AML化疗也是如此并极易复发，LSCs的存在也许解释了AML化疗后易复发的原因。并且，相关报道已证实LSCs在一定程度上对柔红霉素加阿糖胞苷方案不敏感［7］。所以有效针对LSCs的治疗，可能会成为治疗复发难治AML的新策略。

表1 基于CD123单抗药物现状

（二）CD123表达情况

CD123是一种糖蛋白，同时也是白细胞介素3受体跨膜α亚单位（IL-3Ra），与CD131一起组成高亲和力的IL-3受体，一旦与IL-3结合，则促进细胞增殖及存活。

1. CD123正常表达

CD123主要在造血系统中表达，CD123在正常CD34+CD38-细胞中低表达或者不表达［12］，Taussig等［13］发现，在脐带血中大多数CD34+/CD38-细胞表达CD123，而骨髓CD34+/CD38-细胞中CD123+细胞比例较低。此外，正常情况下在髓系祖细胞、B淋巴祖细胞中CD123有较高表达，而红系祖细胞和多向分化潜能祖细胞中低表达或不表达［14-15］；浆细胞样树突状细胞与嗜碱性粒细胞中高表达，而在嗜酸性粒细胞、单核细胞和髓系树突状细胞中低表达［16］。

2.CD123异常表达

CD123在AML-LSC及AML原始细胞均高表达［12，17-18］。在NSG小鼠模型中，CD34+/CD38-/CD123+细胞群较 CD34+/ CD38-/CD123+细胞群有更强的重建AML能力；AML原始细胞中CD123的高表达与信号转导与转录激活因子5（signal transducer and activator of transcription 5， STAT5）信号通路的活化相关。在临床上，初诊时原始细胞数量越高的患者，CD123的表达水平越高；CD123高表达的患者与CD123正常患者相比预后更差［19］。这些研究都说明CD123可能与白血病的发生密切相关。

除了在AML中表达，CD123在慢性粒细胞白血病，骨髓增生异常综合症及肥大细胞增多症，B-细胞急性淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphocytic leukemia，B-ALL）［20］中也有所表达。最近，Du等［21］首次报道T-细胞急性淋巴细胞白血病（T-cell acute lymphocytic leukemia，T-ALL）也表达CD123。

Jingmei等［22］发现CD123在造血干细胞移植后急性GVHD患者中升高，可作为一个重要辅助指标用于鉴别急性GVHD及巨细胞病毒感染，特别是对于胃肠道病变。

CD123是LSCs的主要标志，同时在AML原始细胞中表达比例明显高于正常细胞，尤其是CD34+CD38-细胞，使CD123成为AML靶向治疗可行靶点，并且有望为AML治疗带来新的突破。

（三）靶向CD123抗体药物

目前关于CD123单抗药物的研究总结见表1。靶向CD123的抗体药物虽然均处于早期临床试验阶段，也并未展现出突出疗效，但仍是目前研究的热点。Ⅰ期临床研究中患者表现展现出良好的耐受性，没有出现严重的血液系统不良反应。针对浆细胞样树突状细胞肿瘤的治疗（SL-401）取得了较高缓解率，其中一名患者缓解时间长达20个月以上，但初始有反应的3名患者复发后再次治疗均无效［23］。而在另一项针对AML临床研究（CSL360）中完全反应率较低，仅1/27达CR［20］，说明靶向CD123的抗体药物尚需要通过优化抗体亲和力、多靶点抗体结合等方法，增强抗肿瘤活性。

表2 CART123临床前研究汇总

（四）CD123 CART临床前研究

目前关于CD123的临床前研究汇总于表2，部分研究中发生造血系统毒性，安全性有待商榷。Pizzitola等［25］将CD28、OX40共刺激分子作为胞内段，较二代CAR增加了IFN-γ，TNF-α，TNF-β和IL-2等细胞因子分泌水平，提高了抗肿瘤效应，且没有增加其对造血系统的毒性。Moretti等［16］研究发现，来自脐血的CD34+正常造血祖细胞与CART123共培养后仍保留正常增殖分化能力。Gill等［26］首次提出CART123安全性问题，他们在体外及胎肝CD34+细胞重建的NSG小鼠模型中均观察到CART123引起严重的造血系统，主要是CD34+CD38-细胞，及B淋巴细胞、血小板及髓系细胞数量的减少，并建议将CART123作为一种HSCT前的清髓方案更加安全。当然，不同来源造血组织CD123表达水平不一，Huang等［15］指出在CD34+胎肝细胞中CD123表达水平高于脐血或骨髓来源CD34+细胞。由于个体、组织来源不同均可导致CD123表达水平的差异，故靶向表达CD123正常细胞引起的毒性反应不可避免。选择合理阈值采取干预措施，或通过scFv，CAR结构的改善提高特异性，可能成为未来提高CART123安全性的策略。考虑到AML移植后患者易感染EB病毒，巨细胞病毒等病毒且常规药物治疗疗效差或副作用大，最近Zhou等［28］设计了一种CD123-CAR-VST，既能杀伤CD123+AML细胞又对EMV等病毒感染有一定的控制作用。

表3 其他治疗AML的CART研究进展

Tasian等［29］假设CART123清除体内AML细胞后及时清除CART细胞，能够在一定程度上保持对AML的控制同时减少靶向CD123毒性发生，并且比较了3种不同方法清除CART的效果。

Ruella等［30］发现80﹪的B-ALL原始细胞中表达CD123，并在CD19阴性复发的B-ALL肿瘤细胞中检测到。在体外实验和动物模型中，CART123不仅能有效清除B-ALL肿瘤细胞，并且CART19联合CART123相比CART19能更有效清除CD19阴性复发肿瘤细胞，可能解决目前CART19治疗后复发率的问题。

Celletis公司继UCART19后，研发了异体UCART123，通过TALEN技术敲除TCRα消除GvHD作用，从而可实现“off-the-shelf”，即通过正常供者T细胞大规模制备CART，较自体CART明显缩短制备时间［31］。

（五）CD123 CAR-T临床试验方案

截至目前，有两个CD123 CAR-T治疗AML患者的Ⅰ期临床试验在开展中。第一个是由美国希望之城医学中心注册（NCT02159495），采用CAR123-28z结构，以减少CAR-T体内存留时间，因为文献表明以CD28作为胞内段的第二代CAR结构在体内存活时间仅1个月［32］；并且携带有自杀基因EGFRt，能够在EGFR单抗作用下清除CAR-T。此外，他们将CART123作为allo-HSCT前的清髓方案，以最大限度减少肿瘤负荷［6］。第二个是由Pennsylvania大学注册的CD123-BBz二代CAR（NCT02623582），由于前期研究中发现了对造血系统的损伤，在临床试验中采用电转RNA-CART多次输注策略确保安全。

在57th ASH会议上，Luo等［27］口头报告了首例CART123治疗AML患者案例。他们设计的CD123-scFv/ CD28/CD137/CD27/CD3ζ-iCasp9（4SCAR123）4代CAR在患者接受预处理（CTX 250mg/kg/day3天方案）后输注。输注后患者出现了严重细胞因子风暴综合症，通过单次给与妥珠单抗Tocilizumab（IL-6R拮抗剂）后得到控制。患者的骨髓原始细胞治疗前59﹪，CART输注后20 d降低至40﹪，并尚未观察到严重毒副作用。

（六）其他治疗AML的CAR-T细胞靶点

目前治疗AML的CAR-T研究临床试验注册情况如表3所示，除CD123以外，仅靶向CD33和Lewis Y的研究公布了临床试验阶段的数据。目前主要的AML治疗靶点有CD33，Lewis Y，FRβ。此外，TIM-3，CLL-1等由于其表达特异性，也有望成为AML治疗靶点［11，33］。

1. CD33：CD33（Siglec-3）在90﹪的AML原始细胞中持续表达，同时在多能髓系祖细胞，成熟粒、单细胞及单能干细胞等细胞中表达［34-39］。CD33是AML中第一个用于单抗药物及免疫治疗治疗的表面分子。但由于白血病细胞及正常造血细胞中表达水平相近，缺乏特异性，在临床试验中观察到明确的毒性而致使安全性未得到一直公认［40］。一些关于CART-33的临床前研究显示了其抗肿瘤效应［41］，其中Marin等［42］观察到其对nHPCs的毒性，解放军总医院Wang等［39］开展了全球首例CART-33临床试验（NCT01864902）并且治疗了1例AML患者。尽管观察到了短暂的疗效，其安全性及有效性仍待进一步探讨。不幸的是介于CD33单抗药物GO的严重副作用，关于CD33的临床试验目前被暂停。而Pizzitola等［25］研究发现相比于CART33，CART123有同等的抗AML效应且安全性更好。

2. Lewis Y：Lewis Y是一种功能尚未知的岩藻糖抗原，它在大量蛋白中均可检测到，包括肿瘤相关抗原［43］。并且在包括AML在内的广泛恶性肿瘤中表达拷贝数很高，而在正常组织中表达较低，其表达越多预后越差［44］。

3.FRβ：叶酸受体（FR）家族由α，β，γ和δ 4个已知成员组成的一组叶酸结合蛋白受体，并且这些受体的分布具有组织特异性：FRα主要分布于上皮组织，而FRβ主要分布于髓系造血细胞中［45］。这些受体在恶性肿瘤中普遍出现上调，其中FRβ在70﹪左右的AML患者肿瘤中检测到，使其成为一个AML治疗具有潜力的靶点［46-47］。

五、结论

将目前基于7G3序列的CD123单抗药物在Ⅰ期临床试验中的结果并不理想，而相应的CART123在临床前的试验中显示出明显的抗肿瘤效应［25，48］，说明了CAR-T在髓系肿瘤上应用的潜能。研究已表明，从CAR结构上，4-1BB胞内段能避免T细胞无反应性，并促进T细胞增殖及产生记忆细胞，对T细胞在体内的持续明显优于CD28，且4-1BBL优于4-1BB胞内段设计，而CD28胞内段设计则优于CD80胞外段［49］，意味着未来CAR-T设计将不断优化，获得更好疗效。而同时介于CART123可能带来的造血毒性，增加CART123可控性成为开展临床试验的必要前提。除了瞬时转染、序贯以allo-HSCT以外，还可采用iCAR-T［50］、synNotch CAR［51-52］等设计可能会减少其脱靶效应的发生率；另一方面，采用HSV-TK kinases自杀基因策略，可杀灭增殖中的CAR-T细胞，控制GVHD作用，而保有少量CAR-T在体内，起到免疫监视作用［53］，最新的相关“分子开关”机制，通过抗体药物或小分子药物调控CAR-T在体内发挥作用［54-57］，也给CAR-T治疗可控性带来了新的思路。总而言之，有效的抗肿瘤效果结合适当的可控性，将是未来CART123治疗AML 的发展方向。

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Chimeric Antigen Receptor-modifying Tagainst CD123 for the treatment of AML

Sun Yao，Zhang Bin， Chen Hu. Department of Hematopoietic Stem Cell Transplantation， Affiliated Hospital & Cell and Gene Therapy Center， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100071， China

s: Chen Hu， Email:chenhu217@aliyun.com； Zhang Bin， Email:zb307ctc@163. com

Acute myeloid leukemia（AML）is a refractory hematologic malignancies which still lacks a good prognosis and craves a new treatment. With the progress of the chimeric antigen receptor-modifying（CAR）T cell（CAR-T）technology and the achievement got on the B-cell malignancies，an increasing targets are been investigated， ranging from kinds of hematology to solid tumors. CD123 molecule is a potential target of leukemia stem cells（LSCs）and leukemia blasts，while anti-CD123 CAR-T has the ability to clear the AML leukemia stem cells（LSCs）and blasts. We summarize the current progress and the direction about the treatment of anti-CD123 CAR-T.

Leukemia； Acute； Antigen； Receptor； Stem cells； Interleukin-3 Receptor alpha Subunit； T cells

2016-02-21）

（本文编辑：蔡晓珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.03.009

100071 北京，军事医学科学院附属医院造血干细胞移植科 军事医学科学院细胞与基因治疗中心

陈虎，Email：chenhu217@aliyun.com；张斌，Email：zb307ctc@163.com

孙耀， 张斌， 陈虎. 靶向CD123抗原嵌合受体T细胞治疗急性髓系白血病的研究［J/CD］.中华细胞与干细胞杂志：电子版，2016， 6（3）：184-190.