诱导多能干细胞向运动神经元分化的研究进展

易寰王萱钟秀风彭福华

·综述·

诱导多能干细胞向运动神经元分化的研究进展

易寰1王萱1钟秀风2彭福华1

诱导多能干细胞（iPSC）是通过向已分化成熟的成体细胞转染外源特定的基因重编程而得到的一种类似于胚胎干细胞（ESC）的多潜能干细胞。iPSC克服了ESC临床应用中带来的免疫排斥及伦理问题而具有重要的临床应用价值。iPSC在适当条件下可以实现神经分化，其体外定向分化为运动神经元的研究取得了一定进展。本文就运动神经元的发育、iPSC向运动神经元诱导分化条件、运动神经元鉴定，临床应用及还存在的问题予以综述。

多能干细胞； 运动神经元； 细胞分化

诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）是通过基因转染技术将某些转录因子导入动物或人的体细胞，使已分化的体细胞重编程为类似于胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）的多潜能细胞。2006年，Yamanaka和Takahashi的研究团队［1］在逆转录病毒的介导下将转化因子octamer3/4（oct3/4）、SRY box-containing gene2（Sox2）、c-Myc、Kruppel-like（Klf4）的基因组合导入小鼠胚胎纤维母细胞（mouse embryo fibroblast，MEF）中，并成功获得小鼠iPSC。2007年，他们又将完全相同的人类转化因子组合导入人类真皮成纤维细胞，实现了人类细胞的重编程［2］。iPSC不仅具备多种分化潜能，并且绕开了人类ESC研究中备受争议的伦理问题。同时，从患者特异的自体细胞转化而来的iPSC又可以有效解决移植过程中的免疫排斥问题。种种优点使iPSC在疾病建模、机制研究、药物筛选和替代医学等方面展现出巨大优势［3］。

近年来研究表明，在适当的条件下iPSC可以实现神经分化［4］，其定向分化为运动神经元（motor neuron，MN）为治疗和研究MN损伤疾病例如肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、脊髓肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）等提供了可能性。ALS是运动神经元病（motor neuron disease，MND）最常见的一种，是一组病因未明的选择性侵犯脊髓前脚、脑干、皮质MN的进行性神经变性疾病，以上、下MN损害为最主要的临床特征，目前尚无有效治疗方式。SMA是一种因SMN1基因突变导致的常染色体隐性遗传病，主要表现为MN退化、肌萎缩，肌无力，最终多死于呼吸衰竭。本文就iPSC向MN分化的研究进展及其对于MN相关疾病的治疗前景综述如下。

一、神经系统发生及MN发育过程

在胚胎发育过程中，胚盘逐渐形成内、中、外三胚层结构，神经分化开始于神经外胚层形成时，神经外胚层首先形成盘状结构称为神经盘，神经干细胞位于其中。后神经盘两侧向上卷起于中线融合，形成管样结构称为神经管。神经管内细胞即为神经前体细胞（neural precursor cells，NPC），它们先后经历了前后轴（rostrocaudal axis）、内外轴（mediolateral axis）、背腹轴（dorsoventral axis）神经诱导（见图1），最后分化为区域化的神经元［5］。其中，MN位于脊髓前角，其发生发育先涉及神经化（neuralization）、随后为形成脊髓神经元而非大脑神经元需实现尾端化（caudalization）、最后为背腹轴的腹侧化（ventralization）［6］（图2）。体外诱导MN也是通过上述三步，神经化主要通过抑制骨形成发生蛋白（bone morphogen protein，BMP）和生长转化因子（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路来实现［7］，既往多用Noggin抑制BMP和TGF-β通路，现也有人用LDN193189、SB431542实现［8］。尾端化主要由RA（retinoic acid）调控，另外Wnt和FGF通路也促进神经元尾端化［9-10］。而同时Wnt和FGF通路也促进神经元背侧化，在脊髓发育中表现为中间神经元（interneurons）的形成，而非MN，故主要介导腹侧化的音猥因子（sonic hedgehog homolog，Shh）信号通路在MN的形成中显得尤为重要［11］。

图1 神经轴向发育示意

二、iPSC体外分化为MN

（一）iPSC的建立及其向NPC分化

人类和鼠类iPSC的建立及神经分化大致经历以下几个阶段：用携带oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4的慢病毒感染成体细胞（如人皮肤成纤维细胞、MEF）；病毒感染后出现ESC细胞样克隆，表明成体细胞已经被重编程；挑选具有典型ESC细胞样克隆传代培养并进行AP染色和多潜能性分析，发现其可维持ESC细胞的生物学特性。以上标志成功建立了iPSC细胞系［2］。有报道证明iPSC的生物特性与ESC细胞极为相似［3］。

图2 胚胎发育流程

在诸多诱导方案中（表1），多能干细胞（pluripotent stem cell）向神经干细胞分化主要通过形成拟胚体（embryoidbody，EB）和神经玫瑰花样结构（neural rosette）两种方式实现。拟胚体即细胞在体外模拟胚胎而形成的结构，为iPSC在低吸附培养皿中悬浮培养形成的细胞球结构，EB培养基多为不添加bFGF的干细胞培养基，为促进其向神经分化，后期换为神经分化培养基，辅助以BMP、TGF-β抑制因子，同时也有实验方案加入一些其他小分子，如Y27632促进细胞成团［12］，FGF促进细胞生长。EB形成后接种至Laminin/poly-L-lysine或matrigel包被的培养板继续分化。neural rosette是由iPSC消化后直接接种至包被的培养板上形成的具有分化为多种神经细胞潜能的结构，因形似玫瑰花而命此名。培养基多为神经分化培养基辅以B27、N2等。同样，培养基中可加入BMP、TGF-β通路抑制剂促进细胞向神经分化。由此得到的EB或neural rosette内的细胞即为NPC，表达SOX1、Nestin等泛神经化的标志物［8，13-14］。

表1 多能干细胞向神经前体细胞分化概况

图 3 干细胞逐步诱导为运动神经元的模式

（二）NPC定向分化为MN

上述NPC形成后，向培养基中添加不同诱导因子可以促其进一步分化得到特定神经功能细胞。如前所述，促进已神经化的干细胞向MN分化主要依赖RA的尾端化和SHH的腹侧化。NPC在RA作用下倾向于分化为脊髓祖细胞，接着SHH使脊髓祖细胞进一步分化为表达Olig2的腹侧MN前体。2002年Wichterie等［6］联合应用RA和SHH已成功地将ESC诱导为MN。Karumbayaram等［15］报道应用RA和SHH，同样将hiPSC分化为MN，其分化效率与ESC相似。但是，有研究指出，仅应用RA和SHH却很难促进iPSC向MN转化［16］，应用SHH的同时需要抑制acticin/ nodal信号通路才可以有效促进MN形成［19］。虽然各实验方案所加细胞因子各异，但普遍都应用SHH/purmorphamine和RA，再辅以其他BDNF、GDNF、IGF、cAMP等营养因子实现体外MN诱导［6，8，13-14］（图3）。国内也已有人通过这种方法成功在体外将iPSC诱导形成MN［20］。各实验方案所用剂量各异，RA从1 nmonl/L ～ 1 μmonl/L不等，Shh从50 ～ 500 ng/ml不等［21］。但近期Calder等［22］报道，早期神经化过程中应用模式分子（patterning molecules）处理的干细胞，在向MN分化过程中不加入Shh/purmorphamine也可成功诱导分化成MN，且分化效率同RA+Shh方案。

除了应用动物和正常人来源的iPSC，也有学者将从ALS患者身上获得的成纤维细胞重编程为iPSC，并将其诱导分化为EB，在特定神经诱导培养基作用下进一步分化为MN［23-25］。这为建立体外ALS模型、研究ALS致病机制、干细胞移植治疗提供了基础和依据。

三、MN的鉴定标志

在MN发育过程中会表达多种标志物，体外分化过程中也利用这些标志物显示分化效率。当干细胞向神经分化即形成神经干细胞，会表达诸多神经标志物，常用于检测的有：SOX1、SOX2、Nestin等。当加入RA及Shh调控神经干细胞向MN前体细胞（motor neuron progenitors，MNP）分化时，会表达PAX6、Nkx6、olig2、Islt1，其中PAX6和Nkx6在脊髓中间神经元前体细胞也会表达，而Olig2和Islt1则只在MNP中表达［26］，同时该阶段的神经细胞也会开始表达β-Tublin、MAP2等泛神经标志物［27］。随着MNP向MN分化，细胞会表达HB9、SMI-32，表达HB9意味着细胞进入有丝分裂后（post-mitotic）阶段，此阶段细胞不再增殖，只能向着成熟MN分化［6］。成熟的MN会表达ChAT、VACHT、CHT1等胆碱能标志物［6，8］，其中胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase，ChAT）是催化乙酰胆碱合成的酶，ChAT的活性变化可以直接影响乙酰胆碱的合成，故认为是较重要的MN标志物，大多数体外分化方案都以其作为成熟MN的标志物［13，16］。MN如果与肌肉细胞共培养，形成突触，则会表达SV2、Synaptophysin等突触标志物，并诱导肌肉表达乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，AchR），该受体可用α-bungarotoxin标记［28］。利用这些标志物，在体外分化MN时，可在各阶段行免疫荧光染色以证明。

四、MN的功能检测

定向分化而来的MN鉴定除了上述检测特异性分子标志以外，仍需要进行运动功能的检测。功能检测包括体外功能检测及移植入体内后的功能检测。

1.分化MN体外功能检测：干细胞在体外诱导成MN，除了通过标志物证实，还需要利用膜片钳证明其如正常神经细胞有电生理活动。2004年，Miles等［29］将ESC源的MN和C2C12肌小管共培养形成神经肌肉接头后用膜片钳测试到MN能产生动作电位，且分别加入谷氨酸、河豚毒素后检测到兴奋后的或抑制后的电位。2015年，Jeremy等［30］用iPSC源的MN和鸡的肌纤维共培养形成神经肌肉接头，通过膜片钳检测到类似结果。对MN进行电生理检测已经成为体外诱导分化MN常用的功能学检测手段。

2.分化MN移植到动物体后功能检测：2002年，Wichterie等［6］首次将ESC分化至MN的同时即将HB9阳性的MN植入到MN发育期的鸡胚细胞中，经观察发现植入的MN可以长出突起，并与肌肉联系。Harper等［31］将ESC分化而来的MN植入MN损伤的成年大鼠的脊髓中，观察到植入的MN可以向白质中长出突起。依据ESC早期的研究基础，2013年Amoroso等［8］将iPSC来源的MN移植入鸡胚中，并观察到移植的细胞存活。以上研究证明将MN植入处于发育期或者成体脊髓中，MN可以与肌肉建立联系，也说明体外分化MN在很大程度上同动物体内MN类似。这些尝试为干细胞移植治疗MN疾病提供了实验依据。

五、患者体细胞来源iPSC基因修饰及相关疾病治疗前景

有学者证实iPSC来源的MN移植入体内不仅可以存活，也能用于治疗MN相关疾病，改善预后［32］。ALS的患者中10﹪的属家族性，而SMA则为常染色体隐性遗传病。故理论上，将针对某种遗传病进行基因修饰的iPSC分化为MN，再移植入有该遗传缺陷的患者体内，能够治疗疾病。2012年就有学者将SMA患者的皮肤细胞重编程为iPSC，并向对该iPSC进行基因修饰，使得SMN1表达量上调。分别将正常体细胞来源的iPSC（WT-iPSC）、SMA患者来源的iPSC（SMA-iPSC）、基因修饰的iPSC（TR-iPSC）在体外分化为MN，并移植入SMA疾病模型小鼠体内，证明移植TR-iPSC来源的MN的小鼠中位生存期与移植WT-iPSC来源的MN类似（21 d），但移植SMA-iPSC来源MN的小鼠中位生存期则更短（19 d），未移植的SMA小鼠生存期最短（13 d）［18］。同样，也有学者将ALS患者体细胞重编程为iPSC，经过SOD基因修饰后SOD的表达量上调，结果证实，ALS来源且未经基因修饰的MN易神经丝缠结、轴突退行性变、神经兴奋性高，而经过SOD基因修饰的MN则不易有上述表现，这与ALS患者的病理及神经电生理表现一致［33］。这些都说明，应用iPSC来源的MN移植入体内不仅可以存活，也能用于治疗MN相关疾病，而针对不同疾病的突变基因进行基因修饰的iPSC则是治疗遗传类MN疾病的更好选择。

六、存在的问题与展望

从2002年Wichterie首次利用ESC分化为MN，体外利用干细胞向MN诱导分化已经有十多年历史，各国学者在分化时间、效率、干细胞来源等方面寻求突破，分化时间从早期＞40 d缩短至最快14 d可成功诱导成MN［34］，且早期分化方案最终得到的MN纯度大多在20﹪～ 40﹪［6，14］，但到2015年有学者使诱导效率达到90﹪［13］。这些进步为体外获得的MN进行进一步研究和应用提供了便利。干细胞来源也从最初备受道德争议的ESC拓展到iPSC，且诸多诱导方案应用ALS等患者的iPSC诱导成功［24-25］。这不仅为MND研究提供了体外模型，也为该病药物筛选提供更可靠依据。

尽管多能干细胞向MN定向分化的研究取得了巨大进展，但仍有一些问题待解决。第一、MN的发生过程已有相当多的研究，但针对各种MN亚型的研究还非常有限。就脊髓前角处的MN而言，既有正中运动柱（median motor column，MMC）神经元，也有外侧运动柱（lateral motor column，LMC）神经元，虽均为MN，但MMC处MN支配躯干肌，LMC处MN支配四肢肌。而MND患者肌肉萎缩常从某一类肌肉开始，故体外分化得到MN各亚型显得颇为重要。现阶段虽然体外分化方案繁多，但多是通过神经化、尾端化、腹侧化实现，更为细化的MN亚型分化方案及分化机制仍需探索。近年，有学者发现FoxP1作为Hox辅助因子，能对各个MN种类进行调节进而决定MN多样性［35］，后有学者利用FoxP1作为检验MN亚型的标志物并将干细胞高效分化为LMC处的MN［8］。这些为更加精准的分化提供理论基础和实践方案。第二、虽然现阶段体外分化的MN可以与肌肉细胞产生突触联系，并检测到电生理变化，但两者形成的神经肌肉接头仍相当不成熟，无论是ESC来源还是iPSC来源的MN，其形成的神经肌肉接头不仅非常少而且形态各异［29-30，36］。如何让干细胞来源的MN达到正常人体中MN功能水平，是制约干细胞移植治疗MND的一大瓶颈。

自2006年iPSC技术建立后，近几年iPSC的研究得到极大的发展，将iPSC诱导分化成功能性的MN将会对MND等疾病的治疗、机制研究提供极大的临床价值。但MN各亚型的形成与作用仍需要进一步研究，如何提高iPSC定向分化为MN的效率、纯化MN并使其具有正常的生理功能是当前仍需研究的问题。

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Actuality of motor neurons differentiation from induced pluripotent stem cells

Yi Huan1， Wang Xuan1， Zhong Xiufeng2， Peng Fuhua1.1Multiple Sclerosis Center， Department of Neurology， The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University， Guangzhou， Guangdong 510630， China.2State Key Laboratory of Ophthalmology， Zhongshan Ophthalmic Center， Sun Yat-sen Univeristy， Guangzhou 510600， China

Peng Fuhua， Email: pfh93@163.com； Zhong Xiufeng， Email: zhongxf7@mail. sysu.edu.cn

Induced pluripoent stem cells （iPSCs）， derived from somatic cells by reprogramming with delivery of certain genes， can resemble the characteristics of embryonic stem cells （ESCs） to give rise to all the fully differentiated cells， even tissues. iPSCs avoid the immunological rejection and ethical issues when using ESCs in clinic. Under appropriate conditions，iPSCs can differentiate into nerve cells. At present， scientists have made much progress on the research of motor neurons differentiation from iPSCs. This paper is to summarize the motor neuron development in vivo， the research progress on the differentiation of iPSCs into motor neurons， the identification and function testing of hiPSC-derived motor neurons and the problems to be solved further.

Multipotent stem cells； Motor neurons； Cell differentiation

2016-04-26）

（本文编辑：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.03.008

国家自然科学基金（81570874）；广州市科技计划项目（1563000227）；广东省自然科学基金（2015A03013167）；广东省科技计划项目（2014A020211008；2015A020212011）；中山大学 “百人计划”（PT1001010）

510630 广州，中山大学附属第三医院神经内科1；510600 广州，中山大学中山眼科中心2

彭福华，Email：pfh93@163.com；钟秀风，Email：zhongxf7@mail.sysu.edu.cn

易寰，王萱，钟秀风，等.诱导多能干细胞向运动神经元分化的研究进展［J/CD］.中华细胞与干细胞杂志：电子版， 2016，6（3）：179-183.