早期心肌缺血猝死患者心肌干细胞及高迁移率族蛋白1、miRNA-206表达的变化

谢佳 张雷

·论著·

早期心肌缺血猝死患者心肌干细胞及高迁移率族蛋白1、miRNA-206表达的变化

谢佳 张雷

目的 探讨早期心肌缺血猝死患者心肌干细胞及高迁移率族蛋白1（HMGB1）、miRNA-206表达的变化。方法 收集中国人民解放军第三军医大学第一附属医院2012年10月至2015年10月的100例尸检标本，早期心肌缺血猝死组（n = 40），心肌梗死组（n = 30），正常心肌组（n = 30），运用免疫组织化学二步法染色，采用卡方检验比较分析早期心肌缺血组、心肌梗死猝死组、正常心肌组中心肌干细胞、HMGB1及miRNA-206的表达情况，并采用Spearman相关系数法分析早期心肌缺血组中HMGB1与miRNA-206表达的相关性。结果 早期心肌缺血猝死组中HMGB1的阳性表达率为97.50﹪（39/40）与心肌梗死猝死组100﹪（30/30）比较差异无统计学意义（χ2= 0.761，P = 0.383），但二者均显著高于正常心肌组的3.33﹪（1/30），差异具有统计学意义（χ2=273.297，P = 0.000）；早期心肌缺血猝死组中c-kit+的阳性表达率为77.50﹪（31/40）与心肌梗死猝死组86.67﹪（26/30）比较差异无统计学意义（χ2= 0.953，P = 0.329），但二者明显高于正常心肌组的10.00﹪（3/30），差异有统计学意义（χ2= 2163.431，P = 0.003）；早期心肌缺血猝死组中miRNA-206的表达为正常心肌组的3.02±0.53倍，心肌梗死猝死组中的表达是正常心肌组的4.63±0.71倍，差异有统计学意义（t = 10.870，P = 0.000）；早期心肌缺血猝死组中HMGB1的阳性表达率为97.50﹪（39/40）明显高于c-kit+阳性表达率的77.50﹪（31/40），两组比较差异有统计学意义（χ2= 0.824，P = 0.031）。结论 心肌干细胞及HMGB1、miRNA-206在早期心肌缺血猝死中阳性表达率比较高，正常心肌中均为弱性表达，比较分析三者的差异性表达，可以为早期心肌缺血猝死的死因鉴定提供有效的客观指标。

心肌缺血； 猝死； 干细胞； 微RNAs

心肌缺血是一种常见的心血管疾病，因灌注心脏的血液量减少，造成心脏的供氧不足，心肌能量代谢障碍，心脏无法正常运作。充足的有氧代谢是心脏正常活动的基础，有研究报道，安静状态下心肌的血氧摄取率也可高达70﹪［1］。我国心肌缺血的发病率逐步上升，为中老年群体的多发病与常见病。心肌缺血的首要致病因素为冠状动脉粥样硬化，还可见于血压下降、炎症、创伤和栓塞等。心肌缺血后细胞容易出现损伤坏死，造成心肌梗死或猝死。一过性心肌缺血造成的猝死，心肌组织通常无典型的病理形态改变，因此早期心肌缺血猝死依旧是法医病理学鉴定中的一大难题。相关研究指出早期心肌缺血造成的心肌细胞损伤能够促进心肌干细胞（cardiac stem cells，CSCs）的分化增殖，继而促进受损心肌恢复［2］。CSCs可以分成多种主要类型，其中首要表达的是c-kit+细胞群。高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）是一种非组蛋白染色体结合蛋白，可在心肌细胞受损初期分泌，并参与整个生物学过程。有研究报道，HMGB1是组织损伤的敏感指标，此外HMGB1与miRNA-206的表达同CSCs的分化增殖有着密切的联系［3］。本研究旨在探讨早期心肌缺血猝死患者CSCs及HMGB1、miRNA-206表达的变化。

资料与方法

一、一般资料

收集中国人民解放军第三军医大学附属第一医院2012年10月至2015年10月的100例尸检标本。纳入标准［4］：（1）病史资料保存完整；（2）解剖前尸体冰冻保存良好；（3）心肌组织均经10﹪的福尔马林溶液固定，行常规脱水，石蜡包埋。排除标准：死因尚未明确。

早期心肌缺血猝死组40例，均为首次发病，起病时间急，生存时间短，无中毒症状或者其他系统性疾病，组织学上无心肌梗死变化，冠状动脉主要为支管腔Ⅱ至Ⅳ级狭窄；男性有35例，女性有5例，年龄41 ～ 65岁，生存期0.5 ～ 4 h，死后至解剖时间为8 ～ 24 h。心肌梗死猝死组30例，冠状动脉主要为支管腔Ⅲ至Ⅳ级狭窄，可见心肌梗死的典型改变与陈旧性瘢痕，男性有26例，女性有4例，年龄43 ～ 66岁，生存期0.5 ～ 5h，死后至解剖时间为8 ～ 25h。正常心肌组30例，冠状动脉无狭窄，心脏无病变，为非心源性死亡；男性有23例，女性有7例，年龄39 ～ 62岁，生存期0.5 ～ 4 h，死后至解剖时间为8 ～ 23 h（表1）。

二、方法

1.检测心肌组织中HMGB1及CSCs的表达情况：运用免疫组织化学染色法，心肌组织切片脱蜡至水，切片置入0.3﹪的H2O2浸泡15 min，流水洗净，抗原修复，PBS冲洗1 min，共3次。滴入血清放置10 min，流水洗净，滴入一抗（HMGB1为1：50，c-kit+为1：200）孵育30 min，PBS冲洗2 min，共3次，滴入二抗，孵育30 min，PBS冲洗2 min，共3次，滴入SP复合物放置20 min，PBS冲洗2 min，共3次，滴入DAB显色液放置5 min，流水洗净，苏木素复染细胞核5 min，水洗，分化，蓝化，脱水，树胶封片最后镜检。

2.检测心肌组织中miRNA-206的表达情况：组织切片后置于离心管中，添加1 ml二甲苯，摇晃均匀后采用低温离心机，离心半径3 cm，12 000 r/min的速度，离心2 min，去除上清液，添加1 ml脱水乙醇，摇晃均匀后以12 000 r/min的速度，离心半径3 cm，离心2 min再去除上清液，室温内放置10 min，添加蛋白酶K溶液10 μl与PTL溶液250 μl，摇晃均匀后，60℃环境内放置10 min，再置于80℃环境内15 min，添加裂解液700 μl，摇晃均匀，室温放置2 min，添加0.2 ml氯仿，充分混合后放置室温内3 min，以10 000 r/min的速度，离心半径3 cm，离心10 min后，取出600 μl溶液于新烧杯内，添加300 μl 70﹪乙醇，摇晃均匀后放置于吸附柱RA内，离心半径3 cm，12 000 r/min的速度，离心30 s。收集300 μl的miRNA下滤液，添加150 μl的脱水乙醇，充分混合后置于吸附柱RB内，以12 000 r/min的速度，离心半径3 cm，离心30 s后去掉上滤液，添加漂洗液PW 600 μl，离心60 s后去掉上滤液，滴入漂洗液PW 500 μl，离心半径3 cm，10 000 r/min的速度，离心60 s后去掉上滤液，以10 000 r/min的速度，离心半径3 cm，离心2 min，吸附柱RB移至RNsse free离心管内，滴入RNsse free water 30 μl，室温放置2 min后，离心半径3 cm，12 000 r/min的速度，离心60 s，收集纯净的miRNA置于恒温，20℃中，逆转录后，cDNA置于恒温，20℃中，定量PCR反应，并测定miRNA-206值。

表1 三组患者的基本资料

三、观察指标

观察早期心肌缺血猝死组、心肌梗死猝死组与心肌正常组中HMGB1、c-kit+与miRNA-206的表达，并分析早期心肌缺血组中HMGB1与miRNA-206表达的相关性。

HMGB1结果判定标准［5］：依据心肌组织切片中阳性表达细胞的染色程度可分为：0分不显色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色，HMGB1在心肌细胞胞浆呈棕色即为阳性表达；依据阳性表达细胞的百分比可分为：0分为阴性，1分为≤10﹪，2分为11﹪～ 50﹪，3分为51﹪～ 75﹪，4分为＞ 75﹪。结果为两项指标总得分：0至2分即为（-），3至4分即为（+），6至8分即为（++），9至12分即为（+++）。

CSCs结果判定标准［6］：依据c-kit+阳性细胞表达可分为：阴性0分，0至3分（-），4至5分（+），6至7分（++），≥8分为（+++）。CSCs在细胞膜与细胞质中呈棕色即为阳性。

四、统计学分析方法

采用SPSS18.0统计软件进行数据分析，三组性别、年龄、生存期等一般资料相比较，采用卡方检验和单因素方差分析。年龄、生存期、死后至解剖时间、miRNA-206表达等计量资料表示用± s，组间比较使用独立t检验，HMGB1、c-kit+用［（n）﹪］表示，组间比较则使用χ2检验。以P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、分析比较三组HMGB1在心肌组织中的表达

早期心肌缺血猝死组及心肌梗死猝死组HMGB1阳性表达率比较差异无统计学意义（P ＞0.05），但二者HMGB1阳性表达率均显著高于心肌正常组，两组比较差异有统计学意义（P ＜ 0.05，表2）。

二、比较分析三组c-kit+在心肌组织中的表达

早期心肌缺血猝死组及心肌梗死猝死组c-kit+阳性表达率比较差异无统计学意义（P ＞ 0.05），但二者c-kit+阳性表达率显著高于心肌正常组，两组比较差异有统计学意义（P ＜ 0.05，表3）。

三、比较分析HMGB1与c-kit+在早期心肌猝死组中的表达

早期心肌猝死组HMGB1阳性表达率显著高于c-kit+，两组比较差异有统计学意义（P ＜ 0.05，表4）。

表2 比较三组HMGB1在心肌组织中的表达［（n）﹪］

表3 比较三组c-kit+在心肌组织中的表达［（n）﹪］

表4 分析HMGB1与c-kit+在早期心肌猝死组中的表达（例）

四、比较分析三组miRNA-206表达

miRNA-206在早期心肌缺血猝死组中的表达是正常心肌组的3.02±0.53倍，miRNA-206在心肌梗死猝死组中的表达是正常心肌组的4.63±0.71倍，比较差异有统计学意义（t = 10.870，P = 0.000）。

讨 论

目前，心肌缺血的发病率及病死率逐步上升，严重危害患者的健康。由于生活水平的快速提高，心肌缺血呈现年轻化趋势。心肌急性缺血容易出现局部组织的电生理失常，造成短暂的室颤，甚至猝死。早期心肌缺血猝死依旧为法医病理学鉴定中的一大难题。相关文献指出，miRNA-206能够调控HMGB1促进CSCs的增殖分化［7］。

CSCs位于心肌组织中，研究发现CSCs能够分化增殖为心肌细胞、平滑肌细胞与血管内皮细胞，一旦心肌细胞出现损伤，CSCs能够立刻转移至损伤区域，并且分化增殖新的心肌细胞，修复梗死后的心肌组织。HMGB1是评价细胞受损程度的敏感指标，有研究指出，HMGB1注射至心肌梗死的家兔心脏后能够诱导心肌再生，且梗死部位c-kit+、miRNA表达显著增加，同时小动脉密度与新形成细胞也有所增加［8］，证实HMGB1能够调控miRNA-206表达，诱导CSCs的分化增殖。CSCs可以分成多种主要类型，其中首要表达的是c-kit+细胞群，c-kit+是一种在细胞膜与细胞质呈棕色表达的蛋白，研究指出有c-kit+表达的细胞即可视为CSCs［9］。本研究结果显示，c-kit+在正常心肌组中为弱性表达，早期心肌缺血猝死组有很大部分的阳性表达，差异有统计学意义。正常心肌组织中存在少量棕色的圆形或者椭圆形细胞包膜或者胞质，早期心肌缺血猝死组与心肌梗死猝死组心肌组织中棕色细胞包膜或者胞质较多。由此可见，c-kit+在心肌组织中的表达变以对早期心肌缺血猝死的鉴定有一定的辅助价值。

HMGB1为高度保守的核蛋白，可以调节DNA的基因转录，同时具有释放炎症介质的能力。HMGB1能够主动分泌至胞质或者被动释放至细胞外。Jian等［10］报道，HMGB1在炎性细胞遭受刺激时可以主动分泌至细胞膜外部，调控组织的再生修复。细胞坏死时能够松散HMGB1与DNA的结构，诱导HMGB1被动释放至胞浆或者细胞外。王静等［11］研究报道表明感染、细胞坏死或者凋亡都可以造成HMGB1水平上升。因此心肌细胞缺血造成心肌细胞坏死时，有大量HMGB1被动释放至胞浆或者细胞外。本研究结果显示，HMGB1在早期心肌缺血猝死组阳性表达较强，正常心肌组表达较弱。由于早期心肌缺血猝死的心肌组织病理学改变很小，因此HMGB1可以作为早期心肌缺血猝死诊断的辅助指标。有学者指出，HMGB1能够促进CSCs的再生与分化，修复心肌组织，改善心脏功能；同时也可激活血管干细胞、内皮肌细胞与祖细胞［12］。本研究结果中HMGB1与c-kit+在早期心肌缺血组及心肌猝死梗死组中均为高表达，心肌正常组中均为低表达，证实HMGB1能够激活CSCs，二者呈正相关。miRNA是非编码的小RNA，高度保守，能够调控基因靶RNA的稳定性、蛋白质翻译及基因表达的过程，继而在生物反应学中发挥作用。沈丽娟等［13］研究报道显示，miRNA对于心血管疾病有极其关键的调控作用。成熟的miRNA能够与特定的靶mRNA特异性反应，使特定的蛋白质水平降低。王蕴强等［14］研究发现HMGB1增强心室重构过程中能够促进miRNA-206的表达上调。由于心肌缺血造成心肌细胞坏死后HMGB1被动释放后相应的促进miRNA-206表达上调，本研究结果显示，miRNA-206在早期心肌缺血猝死组及心肌梗死猝死组中的表达无明显差异，但二者均高于心肌正常组，进一步证实HMGB1的表达和miRNA-206表达为正相关。因此miRNA-206能够作为早期心肌缺血猝死诊断的辅助指标。

本研究结果表明CSCs、HMGB1与miRNA-206在早期心肌缺血猝死组及心肌梗死猝死组中均为高表达，正常心肌组中均为低表达，证实三者在心肌组织中的表达存在一定的关联性。综上所述，观察CSCs、HMGB1与miRNA-206在心肌组织中的表达变化，可以为早期心肌缺血猝死的死因鉴定提供有效的客观指标。

1 胡辰晨， 刘嫣方， 苏兆亮. HMGB1在心血管疾病中作用的研究进展［J］. 国际检验医学杂志， 2011， 32（21）：2475-2479.

2 杜银苹， 李东野. 微小RNA在心血管疾病中的研究进展［J］. 中华临床医师杂志（电子版）， 2014， 08（7）：1314-1318.

3 Al-Nimer MS， Rajab BR， Al-Aani HA. Thymoquinone protects the heart against isoproterenol-induced myocardial ischemia in mice： A histopathological study［J］. Indian J Pharmacol， 2016， 48（1）：97-98.

4 李志强， 岳辉， 金在顺， 等. 36例心源性猝死尸检的临床病理学研究［J］. 现代生物医学进展， 2012， 12（26）：5097-5099.

5 刘宇， 曹清心， 张燕， 等. 高迁移率族蛋白B1对心肌缺血再灌注损伤保护作用的初步临床研究［J］. 医学研究生学报， 2012， 25（5）：499-502.

6 李师君. 微小RNAs与心血管疾病［J］. 国际病理科学与临床杂志，2011， 31（6）：513-517.

7 Qin-Wei Z， Yong-Guang LI. Berberine attenuates myocardial ischemia reperfusion injury by suppressing the activation of PI3K/AKT signaling［J］. Exp Ther Med， 2016， 11（3）：978-984.

8 王文靖， 高铁磊， 靳占峰， 等. 心肌缺血猝死心肌中高迁移率族蛋白B-1的表达研究［J］. 中国法医学杂志， 2012， 27（2）：104-107.

9 杨炳强. 心源性猝死的临床常见原因分析［J］. 中国医药指南， 2012，10（4）：156-157.

10 Jian J， Xuan F， Qin F， et al. The antioxidant， Anti-Inflammatory and Anti-Apoptotic activities of the bauhinia championii flavone are connected with protection against myocardial ischemia/reperfusion injury［J］. Cell Physiol Biochem， 2016， 38（4）：1365-1375.

11 王静， 王星， 吴岩， 等. 高血压心肌肥厚大鼠心脏组织中高迁移率族蛋白B-1的表达变化［J］. 标记免疫分析与临床， 2015， 22（7）：687-689.

12 杜君丽， 高成芳， 单丽娜， 等. microRNA在常见致死性心脏病中的改变［J］. 现代生物医学进展， 2015， 15（17）：3386-3388， 3392.

13 沈丽娟， 陆曙. 高迁移率族蛋白B1及其中药抑制剂治疗心血管疾病的研究进展［J］. 中国生化药物杂志， 2015， 35（1）：176-180.

14 王蕴强. 心源性猝死的危险因素和预警因子的探讨［J］. 中国医药科学， 2013， 3（2）：36-37， 55.

Variety of cardiac stem cells and high mobility group box 1 protein， miRNA-206 expression in patient of early acute myocardial ischemic

Xie Jia， Zhang Lei.Department of Emergency， The First Affiliated Hospital of Third Military Medical University， Chongqing 400038， China

Zhang Lei， Email:bachelorforever@sina.com

Objective To investigate the variety of cardiac stem cells and high mobility group box 1 protein （HMGB1）， miRNA-206 expression in patients with early acute myocardial ischemic. Methods A total number of 100 autopsy specimens from October 2012 to October 2015 were collected and divided into early myocardial ischemia sudden death group（n = 40），myocardial infarction group（n = 30）， and normal myocardium group（n = 30）. Two-step immunohistochemical staining，Chi-square test to compare analyzes the expression of early myocardial ischemia group， myocardial infarction， sudden death， and normal cardiac muscle stem cells in the center of the group， HMGB1 and miRNA-206， and the analysis of early myocardial ischemia group HMGB1 and miRNA- using Spearman correlation coefficient correlation between the expression of 206. Results The positive expression rate of HMGB1was 97.50﹪（39/40）and 100﹪（30/30）in early myocardial ischemia sudden death group and myocardial infarction group respectively with no significant difference（χ2= 0.761， P = 0.383）， but both were significantly higher than 3.33﹪（1/30）in normal myocardium group， which was statistically significant（χ2= 273.297， P = 0.000）；The expression of early myocardial ischemia and sudden death group， the rate of c-kit+77.50﹪（31/40）and myocardial infarction， sudden death group 86.67﹪（26/30）the difference was not statistically significant（χ2= 0.953， P = 0.329）， yet both of which were markedly higher than that in normal cardiac group（10.00﹪（3/30）， χ2=2163.431，P = 0.003）. miRNA-206 expression in early myocardial ischemia sudden death group and myocardial infarction group was 3.02 ± 0.53 and 4.63 ± 0.71 times as much as in normal cardiac group respectively. The difference was statistically significant（t = 10.8698，P = 0.000）. In early myocardial ischemia sudden death group， the positive expression rate of HMGB1 was 97.50﹪（39/40）， which was significantly higher than 77.50（31/40）﹪of c-kit+positive expression rate. Thus an obvious difference was shown（χ2= 0.824，P = 0.031）. Conclusion The positive expression rate of cardiac stem cells， HMGB1 and miRNA-206 in early myocardial ischemia sudden death group is relatively high， yet in normal myocardium group， it shows weak expression. Comparative analysis of the differential expression among these three groups could provide objective indicators for identification of early myocardial ischemia sudden death.

Myocardial ischemia； Sudden death； Stem cells； MicroRNAs

2016-04-01）

（本文编辑：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.03.004

重庆市科技传播与普及项目（cstc2016kp-sfhdB0009）

400038 重庆，第三军医大学第一附属医院急救部

张雷，Email：bachelorforever@sina.com

谢佳， 张雷.早期心肌缺血猝死患者心肌干细胞及高迁移率族蛋白1、miRNA-206表达的变化［J/CD］.中华细胞与干细胞杂志：电子版， 2016， 6（3）：155-159.