2011-2013年无锡地区人腺病毒流行特征与分型

马广源 刘瑞霞 肖勇 鲍静 季亚勇 吴家林 凌霞

214023 无锡市疾病预防控制中心(马广源、肖勇、鲍静、季亚勇、吴家林、凌霞)；250031 济南市技师学院(刘瑞霞)



·论著·

2011-2013年无锡地区人腺病毒流行特征与分型

马广源 刘瑞霞 肖勇 鲍静 季亚勇 吴家林 凌霞

214023 无锡市疾病预防控制中心(马广源、肖勇、鲍静、季亚勇、吴家林、凌霞)；250031 济南市技师学院(刘瑞霞)

马广源、刘瑞霞为共同第一作者

目的 了解2011-2013年无锡地区人腺病毒的流行的基因型及规律。 方法 对2011-2013年无锡市人民医院送检的1 893份急性呼吸道感染标本，用Real-time PCR方法扩增腺病毒基因，检出的阳性标本接种Hep-2细胞分离病毒，然后对其扩增产物进行纯化和测序比对，所得基因序列用Bioedit和MEGA 5.0进行进化树分析。结果 2011-2013年无锡地区人腺病毒全年都有出现，多发生在冬春季，1-3岁的儿童检出率(44.26%)最高，型别主要有B亚群的HAdV-3型4株(13.33%)、HAdV-7型6株(20.00%)和C亚群HAdV-1型5株(16.66%)、HAdV-2型8株(26.67%)、HAdV-5型3株(10.00%)、HAdV-6型4株(13.33%)。基因进化树形成2个独立的分支，C亚群逐渐成为优势株。结论 2011-2013年无锡地区人腺病毒有明显的季节性，多发生在冬春季，1-3岁的儿童是主要的易感人群。B和C两种亚群6个血清型为优势流行株，推测有B亚群向C亚群转变的流行趋势。

FondPrograms:ScienceandTechnologyProjectofWuxiScience&TechnologyBureau(CSE31N1430)

急性呼吸道感染(Acuterespiratorytractinfec-tion，ARTI)是全球范围内人类最常见的传染性疾病之一[1]，发病率居急性传染病的首位。ARTI也是威胁儿童健康的主要因素，造成每年大约200万儿童死亡，已成为5岁以下儿童死亡的第二大病因[2]。人腺病毒(Hadv)是引起全球5-10%幼儿和儿童急性呼吸道感染的主要原因，即使在发达国家，低于5岁的儿童急性呼吸道感染较高的死亡率和发病率也造成了一定的社会负担[3]。到目前为止，人腺病毒已发现有60多种血清型[4,5]，A-G7种亚属,型别C1、C2、C5、C6、B3、B7、B11和E4是导致人主要急性呼吸道感染的主要原因。为了解和掌握在无锡地区流行的腺病毒的基因型和特征，对2011-2013年流行的腺病毒进行病毒分离、病毒基因测序以及种属分布及基因特征分析，为预防和控制腺病毒引起的相关传染病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 毒株来源 从无锡市人民医院(儿童医院)采集发病3d以内的急性呼吸道感染病例(发热、白细胞分布异常，咽部不适、鼻塞、流涕、咳嗽等临床表现者，缺乏其他实验室确定诊断依据)的鼻咽拭子或含漱液标本，在4 ℃保存条件下于24h内送至实验室。

1.2 病毒核酸提取及Real-timePCR检测 用罗氏公司的RocheMagNAPureLC2.0 全自动核酸提取仪提取总核酸(DNA/RNA)，提取物用100μl洗脱液溶解，立即置-70 ℃冰箱保存备用。应用北京金豪科技有限公司的荧光定量RT-PCR核酸检测试剂盒检测腺病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒。

图1 2011-2013年无锡地区人腺病毒流行Fig.1 Prevalence of human adenoviruses in Wuxi area from 2011 to 2013

1.3 Hep-2细胞培养 选择荧光PCR检测结果为腺病毒阳性的标本，0.22 μm滤膜过滤，接种长成单层的Hep-2细胞，常规培养，每日观察细胞病变。

1.4 Hexon基因扩增及序列测定 合成腺病毒Hexon基因测序引物，用TaKaRa公司的EX Taq 试剂盒(Drr001r)进行扩增，由上海美吉生物医药科技有限公司测定序列。

1.5 基因比对和种系发生树构建 使用Bioedit 进行序列的比对和分析, MEGA version 4.0 软件绘制基因种系发生树，进化树构建采用邻位相临法(Neighbor-Jointing, N-J)。

2 结果

2.1 2011-2013年无锡地区人腺病毒流行情况 2011-2013年共检测到人腺病毒61株，这期间甲型流感病毒和乙型流感病毒共同流行。人腺病毒占同期所有标本的3.22%(61/1 893)，而甲型流感病毒占同期所有标本的6.55%(124/1 893)，乙型流感病毒占同期所有标本的3.75%(71/1 893)。从图1看出人腺病毒在全年都有出现，多发生在冬春季，夏季仅在2011年的6月份出现4株，2013年的6、7月各出现1株，其余均未检测到。

2.2 人腺病毒感染人群分布和临床特征 61份检出阳性标本的感染人群都为儿童，最小2个月，最大8岁。感染患儿各年龄段都有分布，小于1岁的患儿有11例，占18.03%；1-3岁的儿童发病率最高有27例，占44.26%；3-6岁的儿童有15例，占24.59%；大于6岁的儿童有8例，占13.11%。男、女性别比例为29∶32。61份感染人群中有发热症状的45例，占73.77%；有咳嗽症状的36例，占59.02%；有咽炎症状的30例，占49.18%；有肌肉酸痛症状的30例，占49.18%；有肺炎症状的26例，占42.62%。

图2 2011-2013年无锡地区人腺病毒hexon基因进化树Fig.2 Phylogenetic tree of HAdV hexon gene in Wuxi area during 2011-2013

2.3 2011-2013年无锡市人腺病毒分子分型特征 61份核酸阳性标本进行病毒分离，有30份出现明显的细胞病变，病毒分离率为49.18%。对这30份标本进行病毒基因PCR扩增、测序并鉴定其型别。30株分离株序列及GenBank中19株人腺病毒代表株序列进行种系进化树分析，结果显示2011-2013年30株人腺病毒分离株分属2个进化分支，属于2个亚群(亚群B、C)中的6种型别。C亚群占66.67(20/30)，B亚群占33.33%(10/30)。三年中都出现B亚群和C亚群，2011年B亚群居多有5株、而C亚群只有2株；2012年B亚群有3株、C亚群有8株；2013年B亚群有2株、C亚群有10株。B亚群中HAdV-3型2012年未检出，而C亚群中HAdV-6型2011年没有出现，HAdv-5型仅在2013年出现。由此可看出无锡地区腺病毒流行趋势由B亚群向C亚群转变。

2.4 各型别腺病毒hexon基因核苷酸序列亲缘性关系及氨基酸同源性分析 利用 Bioedit 和 MEGA5.0 软件对HAdV-3、7、1、2、5、6序列及 Genbank中相应型别hexon基因全长序列参考株进行亲缘性关系分析，其中Hadv-3参考株1株、HAdV-7参考株1株、HAdV-1参考株1株、HAdV-2参考株3株、HAdV-5参考株1株、HAdV-6参考株1株。从图2清晰的看到，2011-2013年无锡市20株人腺病毒Hexon基因分处进化树的B、C亚群，分支独立，彼此间亲缘关系清晰。各HAdV型别与其对应的参考株同源性较高，同源性在96.13%-100%之间，最高同源性为HAdV-7型，最低同源性为HAdV-6型。

3 讨论

腺病毒是引起人急性呼吸道感染的重要病毒病原之一，在不同国家、地区流行的腺病毒都会有所不同[6]，有些型别可能在一个国家多个地区之间交替流行[7]。北方地区如北京2003-2012年监测结果显示呈全年散发，没有明显的季节差异，1-3岁为易感人群[8]。南方地区如苏州2005-2007年腺病毒住院感染病例呈春、夏季明显高于秋、冬季，1-2岁检出最多[9]。无锡地区2011-2013年监测结果显示Hadv呈现明显的季节性，主要以冬春季为主，夏季检出很少；1-3岁的儿童发病率最高，占44.26%；大部分患儿伴有发热、咳嗽等症状。

本研究报道了2011-2013 年间无锡地区儿童感染呼吸道腺病毒的流行状况及分型结果，显示近三年引起呼吸道腺病毒感染的型别主要为B、C亚群，而B亚群主要为3型和7型，这与中国其它地区关于HAdV的检测结果相似，也与亚洲地区[10]主要以HAdV-3、7在儿童呼吸道感染中占主要地位结果一致。但是在本次研究中C亚群成为主导毒株，与其他研究结果[11,12]B亚群为主导不同。从进化结果来看有B亚群向C亚群转变的流行趋势，且在2013年C亚群检出Hadv-5型。从亲缘进化树和氨基酸同源性分析的结果来看，本研究中腺病毒各型别序列与相应参考株的氨基酸的同源性均较高，且均未发现明显的变异，Hadv-7型同源性非常之高。腺病毒是DNA病毒，它们的进化速度相对较慢。

腺病毒引起的儿童感染近几年趋势有明显的回升，且症状比较重，个别地方会出现散在性暴发疫情。因此，我们应该加强对腺病毒分子流行病学的连续监测，开展流行病学调查、疫苗研发就显得尤为重要。

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Epidemiological characteristic and typing of human adenovirus in Wuxi area of 2011-2013

MaGuangyuan，LiuRuixia,XiaoYong，BaoJing，JiYayong，WuJialin，LingXia

WuxiCenterforDiseaseControlandPrevention,Wuxi214023,China(MaGY,XiaoY,BaoJ,JiYY,WuJL,LingX);Ji′nanTechnicanColloge,Ji′nan250031,China(LiRX)

MaGuangyuanandLiuRuixiaarethdfirstauthorswhocontributedequallytothearticle

LingXia，Email：mgy2004165@163.com

ObjectiveTostudytheepidemiologicalcharacteristicsandtypeofhumanadenovirus(HAdv)inWuxiareain2011-2013.MethodsAtotalof1983acuterespiratoryinfectionssampleswerecollectedfromWuxiPeople′sHospitalduring2011-2013.HAdvwasdetectedbyReal-timePCR,thepositivesampleswereinoculatedintoHep-2cellstoisolatetheviruses.Theamplificonswerepurifiedandsequenced,andthesequenceswereanalyzedbyBioeditandMEGA5.0.ResultsHumanadenoviruswasappearedthroughouttheyearinWuxiareaduring2011-2013.Inwinterandspring,thehighestrate(44.26%)wasdetectedin1-3yearsoldchildren.Therewere4strains(13.33%)forHAdV-3, 6strainsforHAdV-7(20.00%)ofBsubgroup,5strains(16.66%)forHAdV-1, 8strains(26.67%)forHAdV-2, 3strains(10.00%)forHAdV-5, 4strains(13.33%)forHAdV-6ofCsubgroup.ThephylogenetictreeformedtwoindependentbranchesandCsubgroupgraduallybecameadvantage.ConclusionsHumanadenovirushadobviousseasonalcharacteristicsinWuxiareaduring2011- 2013,mainlyinwinterandspring; 1-3yearsoldchildrenwerethemainsusceptiblepopulation.SixtypesofBandCsubgroupswerethedominantepidemicstrains,withtheepidemictendencytransformedfromsubgroupBtoC.

HumanAdenovirus；EpidemiologicalCharacteristics；Genotype

凌霞，Email：mgy2004165@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.010

人腺病毒；流行特征；基因型

无锡市科技局支持项目(CSE31N1430)

2016-06-06)