PCR-RFLP方法快速鉴别水痘-带状疱疹病毒野病毒与疫苗株

周珺 龚甜 熊英 施勇

330029 南昌，江西省疾病预防控制中心



·技术方法·

PCR-RFLP方法快速鉴别水痘-带状疱疹病毒野病毒与疫苗株

周珺 龚甜 熊英 施勇

330029 南昌，江西省疾病预防控制中心

目的 PCR-RFLP的方法快速鉴别2010-2015在江西省采集的水痘-带状疱疹标本中的野病毒与疫苗株。方法 选取2010-2015年在江西省南昌市采集的的水痘-带状疱疹感染临床诊断病例的疱疹液和咽拭子标本共112份，分别使用特定引物对水痘-带状疱疹病毒(VZV)ORF62区、ORF38区和ORF54区进行扩增，对阳性扩增产物分别使用限制性内切酶SmaⅠ、PstⅠ及BglⅠ进行酶切，对酶切产物进行片段长度多态性分析。结果 112份标本中，39份标本的病毒核酸经特定区域的PCR扩增后，对产物进行酶切结果为SmaⅠ-、PstⅠ+及BglⅠ+，而疫苗株酶切的结果为SmaⅠ+、PstⅠ-及BglⅠ+。结论 PCR-RFLP方法可以快速鉴定VZV的野毒株与疫苗株，江西省2010-2015年采集的水痘-带状疱疹标本中的VZV均为野病毒。

Fund programs: Science and Technology Plan of Jiangxi Province Health Department(20112001);National Science and Technology Major Projects of the 11thfive-year plan for Major Communicable Diseases, AIDS and Viral Hepatitis Prevention(2009ZX10004-207)

水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus, VZV)又被称为人类疱疹病毒3型(HHV-3)，是临床上常见的水痘和带状疱疹疾病的病原体。Takahashi等在1974年利用水痘病毒野毒株Oka(Oka parent, pOka)成功研制出水痘减毒活疫苗株(Oka vaccine, vOka)并广泛用于预防接种[1]，显著降低了儿童罹患水痘和老年带状疱疹后出现遗神经痛的发生率。目前在市场上采用的水痘疫苗均是1983年被世界卫生组织推荐的日本的vOka株的减毒活疫苗。但因为水痘疫苗是减毒活疫苗有可能会引起突破感染或是产生疫苗相关病例，因此在广泛使用该疫苗的同时，有必要检测水痘病例或带状疱疹病例中的VZV毒株是由疫苗株还是野毒株感染引起。这对水痘疫苗接种效果的评价、疫苗的安全性及质量控制等具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2010-2015年在南昌市高新区医院及采集的临床诊断为水痘-带状疱疹患者的疱疹液和咽拭子标本共112份，标本采集后置于-70 ℃冷冻保存。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 试剂DNA提取:试剂盒QIAmpDNA Mini kit(德国Qiagen公司，51306)，DNA扩增试剂盒GoTaq Green Master Mix(Promega公司，0000031171)，限制性内切酶SmaⅠ、BglⅠ及PstⅠ(TaKaRa公司，D1085A，D1020A，D1073A)，琼脂糖凝胶(上海生工，AB0016H-250G)，GOLD VIEW染料(Solarbio，G8140)，水痘病毒减毒活疫苗(长春祈健生物制品有限公司，201301008)。

1.2.2 仪器:CO2培养箱(美国NuAire)，PCR扩增仪PTC-200(美国Bio-Rad)，凝胶电泳仪(北京六一)，全自动凝胶成像仪(Vilber Lourmat)。

1.3 方法 使用QIAmpDNA Mini kit DNA提取试剂盒对原始标本提取病毒核酸，提取过程按照试剂盒说明书操作；使用特异性引物扩增相对应的基因片段，引物序列及对应所用的限制性内切酶[2]。使用Promega公司的GoTaq Green Master Mix试剂对病毒核酸进行扩增。

参考本实验室已建立的限制性内切酶分析方法[3]及参考限制性内切酶试剂说明书进行酶切反应。

2 结果

使用三对引物对原始标本的核酸进行PCR扩增，共有39份标本的产物浓度足够进行酶切实验。对这些产物进行限制性酶切位点分析，发现使用引物PKVL6U/PKVL1L扩增的ORF62区域的产物片段经Sma I酶切可均被切分为3个片段(153 bp、79 bp、36 bp)，而疫苗株则能被切为4个片段(112 bp、79 bp、41 bp、36 bp)，即疫苗株有3个酶切位点(其中153 bp片段被切为112 bp及41 bp两个片段)(见图1)，而野毒株只有2个酶切位点，即野毒株表现为Sma I-、疫苗株为Sma I+；同时，各个标本的特异性扩增产物皆可被Bgl I及Pst I酶切为两个片段 (137 bp、85 bp和250 bp、100 bp)，而疫苗株则未能被Pst I酶切(见图2)。最后能够进行酶切的39份标本中的病毒皆为Bgl I及Pst I酶切阳性，均为VZV病毒野毒株。

图1 部分标本Sma I酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of the PCR products digested by Sma I

图2 部分标本Bgl I及Pst I酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of the PCR products digested by Bgl I and Pst I

3 讨论

VZV原发感染表现为水痘，主要的发病人群为儿童，主要以皮肤和黏膜上出现疱疹并且伴有发热为特征；而在水痘症状痊愈后，病毒并不能被机体完全清除，它常在一个或多个脊髓后根神经节或三叉神经节中潜伏下来形成潜伏感染。当机体抵抗力降低时，病毒会再被激活并复制，沿神经轴突到达相应神经所支配的胸、腹或面部的皮肤，并在局部细胞内增殖，引发周围神经炎及相应分布区域皮肤的炎症，临床表现为在相应神经支配的皮肤上出现疱疹，并产生神经痛。因病灶主要呈带状分布，故又常被称为带状疱疹[4，5]。

水痘疫苗接种仍后可发生水痘样皮疹，接种的疫苗也可潜伏体内引发出带状疱疹。美国一项调查显示：水痘减毒活疫苗不能提供100%完全的保护，疫苗接种后数月到数年内，约有5%儿童和10%成人仍有可能感染VZV，一部分是“突破(breakthrough)感染”，即疫苗没有起到保护的效果而使机体仍然被病毒感染，而另外一部分则是由疫苗株引起的占40%[6，7]，是为疫苗相关病例。所以水痘疫苗接种者仍然发生水痘或带状疱疹可能是由野毒株或疫苗株感染所致[8]。因疫苗株可引起感染导致水痘，不仅如此，它还可与野生毒株一样，潜伏在接种者的感觉神经节中，并能被再次激活而引发带状疱疹[4]，因此在广泛使用减毒活疫苗的同时，也有必要检测水痘或带状疱疹病例感染的VZV病毒是否由疫苗株引起。这对水痘疫苗接种效果的评价、疫苗的安全性及质量控制等具有重要意义。

限制性片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphism，RFLP)的原理是检测DNA被限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生的或去除酶切位点)和一段DNA的重新组织(如插入或缺失造成酶切位点间长度发生变化)等均可导致RFLP的产生。传统的鉴定VZV毒株是否为野毒株基本都是使用PCR-RFLP的方法。一些早期研究发现，在北美和欧洲，绝大多数VZV毒株在ORF38中基因组核苷酸中都含Pst I酶切位点(即PstI+)，而在ORF54中不含Bgl I酶切位点(即Bgl I-)；而源自日本的疫苗株，因点突变失去了Pst I酶切位点(PstI-)，却形成了一个 BglI酶切位点(即BglI+)。因此在早先的研究中，曾提出以Pst I和Bgl I双酶切来区分野毒株和疫苗株[9，10]。而Loparev等[2]建立了一种更为简单的方法可以鉴定和区别VZV野毒株和减毒疫苗株：通过病毒基因组测序比较发现，疫苗株vOka ORF62中因点突变增加了一个Sma I酶切位点(Sma I+)，而野毒株则没有这个位点，故此位点为疫苗株所独有。可以使用Sma Ⅰ对ORF62区域的扩增产物进行酶切,因疫苗株中有3个SmaⅠ酶切位点，能被切为4个片段，而野毒株中只有2个，只能被切为3个片段。该方法能准确的将疫苗株和流行于6个洲的野毒株区别开来。

本研究收集到的39份标本中的VZV均为VZV野毒株，时间横跨2010年至2015年，这说明江西省一直都有VZV的野病毒流行，而我省这些野病毒的酶切结果均为Sma I-、Pst I+及Bgl I+，这与日本本土流行的野毒株pOKa株(Sma I-、Pst I-及Bgl I+)不一样，与我国李崇山[11]、陈婷婷等[5]的报道一致，说明我省乃至我国流行的VZV毒株大多数为Sma I-、Pst I+及Bgl I+，但甘霖[12]等研究发现我国也存在PstI-的野毒株，说明我国也可能有类似日本本土流行株的野毒株存在，甚至有可能存在与北美欧洲等地流行相同的野毒株，这有待更多的研究来发现。本研究验证了通过Sma I酶切的方法可以快速鉴别VZV疫苗株与野毒株，与Pst I及Bgl I联用更可以鉴别是否有与日本本土的相同的流行野毒株，而不用通过测序的方法来进行鉴别，可以节省较多的时间，使用的仪器设备及试剂耗材也较为简单，利于一些基层实验室或只有基本条件的实验室进行研究，也利于在我国更广泛的开展水痘-带状疱疹的监测工作。

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Rapid identification varicella zoster virus wild and vaccine strains by PCR-RFLP

ZhouJun,GongTian,XiongYing,ShiYong

JiangxiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanchang330029,China

ZhouJun,Email：94396465@qq.com

Objective To rapidly identify wild strains and vaccine strains of varicella zoster virus(VZV) by PCR-RFLP in Jiangxi province in 2010-2015. Methods We have collected 112 herpes fluid and throat swab specimens from clinical diagnosis cases of varicella zoster in Nanchang from 2010 to 2015, extracted virus DNA from the specimens, used the specific primers of ORF62, ORF38 and ORF54 areas,and used restriction enzymes SmaⅠ, PstⅠ and BglⅠto do fragment length polymorphism analysis.Results We have analysised results the of 39 positive PCR products and all the products can be digested by SmaⅠ-, PstⅠ+and BglⅠ+,but the RFLP result of vaccine is SmaⅠ+, PstⅠ-and BglⅠ+.Conclusions The wild strains and vaccine strain of VZV be identified by the method of PCR-RFLP and the VZV the specimens collected in Jiangxi Province from 2010 to 2015 are all wild strains.

Varicella zoster virus (VZV); Wild strains; Vaccine strains; PCR-RFLP

周珺 Email：94396465@qq.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.018

水痘-带状疱疹病毒；野毒株；疫苗株；PCR-RFLP

江西省卫生厅科技计划课题(20112001)；国家“十一五”科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”(2009ZX10004-207)

2016-05-17)