河南省2012-2015年儿童A组轮状病毒病原学监测及基因型别分析

赵嘉咏 申晓靖 张白帆 黄丽莉 夏胜利 黄学勇 许汴利

450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病所实验室



·论著·

河南省2012-2015年儿童A组轮状病毒病原学监测及基因型别分析

赵嘉咏 申晓靖 张白帆 黄丽莉 夏胜利 黄学勇 许汴利

450016 郑州,河南省疾病预防控制中心传染病所实验室

目的 分析2012-2015年河南省5岁以下腹泻儿童A组轮状病毒的感染状况及病原学特征，为A组轮状病毒感染的监测、防控及爆发病例的调查及疫苗研发提供基线数据和方法学参考。方法 采集河南省两个监测哨点医院5岁以下儿童腹泻病例的粪便样本1 433份。双抗体夹心法检测A组轮状病毒，阳性样本抽提病毒RNA，两步巢式多重RT-PCR进行G/P基因分型。结果 1 433份腹泻样本共检出A组轮状病毒482份，总阳性率33.6%；轮状病毒检出率的季节性特征显著，存在秋季(9-11月份)和春季(3-5月份)两个较为显著的高峰。A组轮状病毒G分型以G1、G2、G3、G9为主；P分型以P[4]、P[8]为主；型别组合以G9P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G1P[8]为主；还存在混合感染型别。阳性病例中，男女性别比1.4∶1；以4-12个月龄的婴幼儿为主；农村感染率高于城市；临床症状以轻中度腹泻为主，部分病例存在发热、呕吐、脱水等现象。结论 河南省5岁以下腹泻患儿中存在较高的A组轮状病毒感染率，以秋季和春季为主，且存在混合感染病例；病原体可分为多种基因型别，G9P[8]为优势型别；大部分感染病例以轻症为主。

Fundprograms:NationalScienceandTechnologyMajorProjectsofChina(2012ZX10004201; 2012ZX10004215);ScientificandTechnologicalProjectofHenanProvinve“Moleculartypingandnetworktracingtechnologyapplicationresearchofbacterialpathogens(152102310133)”

人感染A组轮状病毒(HumanRotavirusA，HRVA)是一种双链RNA病毒，呼肠孤病毒科轮状病毒属，是引起婴幼儿秋季腹泻的主要病原体之一，其通过感染小肠黏膜上皮细胞，造成细胞损伤，引起渗透性腹泻病。A组轮状病毒在每年的秋冬季流行，感染途径为粪—口途径，临床表现为急性胃肠炎，可导致发热、呕吐、腹泻及脱水等严重并发症[1，2]。本研究对河南省2012-2015年采集自5岁以下婴幼儿腹泻粪便中的A组轮状病毒进行病原学检测与基因型别分析，为其疾病监测、防控策略制定、暴发疫情调查及疫苗研发提供基线数据与科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源 依据中国疾控中心《全国病毒性腹泻监测方案(2007版)》制定的病毒性腹泻病例定义，对河南省郑州市和开封市两家儿童医院5岁以下(1-59月龄)腹泻患儿，每日排便3次或3次以上，且大便性状有改变，呈稀便、水样便等；大便常规镜检WBC<15，未见RBC的病例进行腹泻样本采集。2012年332份，2013年375份，2014年311份，2015年415份，共计1 433份。

1.2 样本采集与保存 粪便标本在患者发病3d内或入院24h内采集，固体便每份取5-10g，水样便或稀便每份取5-10ml，采集的标本放入螺口采样盒中置于-20 ℃冻存，在检测前避免反复冻融。

1.3 试剂与仪器 双抗体夹心法ELISA检测试剂盒购自英国Oxoid公司；磁珠法病毒核酸提取试剂盒购自西安天隆科技公司；SuperScriptⅢ逆转录酶购自美国invitrogen公司；dNTPMIX、GoTaqDNA聚合酶购自美国Promega公司；引物(HPLC纯化)由上海invitrogen合成；100bpMarker购自大连宝生物生物技术公司；电泳琼脂糖购自西班牙Biowest公司；50×TAE电泳缓冲液购自北京Solarbio公司。自动核酸提取仪购西安天隆科技公司；去离子水系统购自美国Milipore公司；Minispin台式离心机、PCR仪购自德国Eppendorf公司；核酸电泳及凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.4 样本抗原检测 粪便样本置于室温自然解冻，每人份取0.1g固体粪便或100μl液体粪便标本加入1.0ml样品稀释液(试剂盒所配)至1.5mlEP管中，参照试剂盒说明书进行样本处理与检测。

1.5 病毒RNA的提取及A组轮状病毒基因分型 取样本稀释液200μl，使用磁珠法自动核酸提取仪(西安天隆NP968型)进行病毒总RNA提取。提取产物参照世界卫生组织(WHO)轮状病毒参比实验室提供的A组轮状病毒G(病毒外壳蛋白VP4)/P(病毒外壳蛋白VP7)基因分型引物序列及试验方案进行，其中G分型包括G1/G2/G3/G4/G8/G9/G10/G11 8条引物，P分型包括P4/P6/P8/P9/P10/P11 6条引物。

1.6 电泳与结果判断 取10μlPCR扩增产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳(140V,30min)。根据特异性核酸条带大小和数目组合判断A组轮状病毒基因类别。

2 结果

2.1A组轮状病毒ELISA检测 1 433份腹泻样本共检出A组轮状病毒482份，总阳性率33.6%。其中2012年检出107份，阳性率32.2%(107/332)；2013年检出174份，阳性率46.4%(174/375)；2014年检出86份，阳性率27.7%(86/311)；2015年检出115份，阳性率27.7%(115/415)。分月份看，每年的10月份阳性率最高，4年的平均阳性率为57.5 %；阳性率最低的是每年的7月份，4年的平均阳性率为3.0%。检出率的季节性变化显著，存在秋季(9-11月份)和春季(3-5月份)两个较为显著的高峰(图1)。

图1 2012年-2015年河南省腹泻样本A组轮状病毒检出率变化趋势Fig.1 Detection rate trend of rotavirus A in Henan province from 2012 to 2015

2.2 A组轮状病毒GP基因分型结果 482株A组轮状病毒G分型为G1、G2、G3、G4、G9；以G1、G2、G3、G9为主；P分型为P[4]、P[6]、P[8]、P[9]；以P[4]、P[8]为主。A组轮状病毒型别有G1P[8]，G2P[4]，G2P[8]，G3P[8]，G4P[9]，G9P[4]，G9P[8]，以G9P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G1P[8]为主。另外经测序证实还存在混合感染的型别，有G1G3P[8]，G2G3G4P[8]，G3G9P[8]，G3G8G9P[6][8](表1，图2)。

表1 2012年-2015年河南省A组轮状病毒G/P基因分型

注：P[+]为P未分型

Note:P[+] untyped P

M:100 bp DNA marker; G9P[8]:1,2,5,6,8,9,11,13,16:G2P[4]:3,7,12,14;Mix types:4,10,15 图2 A组轮状病毒G/P分型 Fig.2 Map of rotavirus A G/P genotyping

2.3 A组轮状病毒感染病例流行病学资料分析 482例A组轮状病毒感染病例中，279例为男性，203例为女性，男女性别比1.4∶1；年龄分布为：0-3个月32例(6.6%)，4-6个月211例(43.8%)，7-12个月104例(21.6%)，1岁-2岁54例(11.2%)，2岁-3岁40例(8.3%)，3岁-4岁29例(6.0%)，4岁-5岁12例(2.5%)，阳性病例主要为4-12个月龄的婴幼儿患者；城市阳性病例224例，阳性率25.8%(224/867);农村阳性病例258例，阳性率45.6%(258/566)；从临床体征看，431例阳性病例体温在37 ℃以下(89.4%)，29例体温在37-37.5 ℃间(6.0%)，14例体温在37.6-38 ℃间(2.9%)，8例体温在38 ℃以上(1.6%)，大部分的阳性病例不发热或轻度发热；89例腹泻次数在0-3次(18.5%)，275例腹泻次数在4-6次(57.1%)，78例腹泻次数在7-9次(16.2%)，40例腹泻次数在10-15次(8.3%)，阳性病例以轻度和中度腹泻为主；437例未发生呕吐(90.7%)，17例发生1次呕吐(3.5%)，21例发生2次呕吐(4.4%)，5例发生3次呕吐(1.0%)，2例呕吐在4次以上(0.4%)，阳性病例绝大部分未出现呕吐症状；398例未发生脱水现象(82.6%)，81例发生1%-5%的轻度脱水现象(16.8%)，3例发生5%以上的中重度脱水现象(0.6%)。

3 讨论

病毒性腹泻，又称为病毒性胃肠炎，在我国传染病防治法中被列为丙类传染病。轮状病毒由澳大利亚的Ruth Bishop于1973年进行电镜研究时首次发现，根据病毒内壳蛋白VP6抗原性不同将RV分为A-G 7个组，其中A、B、C三组可以感染人[3]。A组轮状病毒为较为少见的双链RNA病毒，颗粒直径70 nm，二十面体对称，是5岁以下儿童感染性重症胃肠炎(腹泻)的主要病原，其通过侵犯小肠绒毛柱状上皮细胞，引发肠道吸收功能障碍及水样腹泻，导致脱水、电解质失衡与酸中毒，还可通过胃肠道屏障到达血液循环与淋巴循环系统，从而引发病毒血症和多脏器损害，是导致婴幼儿腹泻和死亡的重要疾病之一，占腹泻住院儿童的比例为20%-60%。根据WHO估算，全球范围内每年大约引起61.1万婴儿和儿童死亡，特别是在非洲，亚洲及南美洲等发展中国家[4，5]。轮状病毒感染属于自限性疾病，由于常规的卫生和消毒措施对阻止病毒感染的效果并不明显，接种疫苗成为了当前世界范围内预防该病的主要医疗手段。2009年6月，WHO已建议把轮状病毒疫苗接种列入所有国家的免疫规划中[6]。由于A组轮状病毒抗原型别的复杂性、多样性及变异性，持续开展其病原学监测，掌握其感染状况及基因型别的分布和变异趋势对于开展疾病负担调查，制定防控策略能够提供重要的基线数据，同时为疫苗研发和改进也提供了最关键的参考依据。

A组轮状病毒核衣壳蛋白可分为外壳蛋白和内壳蛋白，外壳蛋白以VP4和VP7为主，是A组轮状病毒主要的抗原决定子，其所对应核酸序列是进行G/P基因分型的依据。全球不同地区流行病学调查表明，不同的时间、不同的地区其流行株有较大差异。 Gl/G2/G3/G4、P[4] /P[6]/P[8]是世界范围内包括中国最常见的优势株型，直到上世纪90年代中叶，最常见的四种组合依然为G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]和G4P[6][7，8]。近年来，HRVA又呈现新的分子流行病学特点，G9型呈快速上升趋势，G9P[8]型别已成为第5种新的流行型别[9]。从本研究看，河南省HRVA的基因型别以G9P[8]、G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]为主，这和目前世界范围的HRVA的病原学特征和流行趋势是一致的。从河南省的历史监测数据看，G9P[8]是型别占比上升最为迅速的型别，其从2006年的不足3%升至2015年的65.6%，已成为河南省5岁以下儿童HRVA感染的主要型别。另外河南省HRVA病原学的另一个特点就是存在混合感染型别，由于HRVA的易感性、抗原多样性及机体感染后免疫力难以持久和交叉免疫保护力弱等特点，5岁以下儿童感染率可接近100%，且易形成不同型别的反复感染，因此在同一病人体内检测出多种型别的混合感染是可以解释的。

从阳性病例的流行病学资料来看，河南省HRVA感染的男性多于女性，年龄分布以4个月-1岁为主，2岁-5岁间感染率呈下降趋势。农村感染率显著比城市高，这与河南省细菌性腹感染率泻的城乡差别一致。临床症状主要还是以轻症腹泻为主，体现了HRVA致病力和毒力较弱的特点。从检出率的时间变化趋势看，河南省的HRVA感染除了具有“秋季腹泻”的季节性特点外，在春季也存在一个小高峰。研究表明，HRVA的环境存活状况与温度和湿度密切相关[10]，河南省作为中部偏北地区，春季和秋冬季大气环境方面近似，温度与湿度相差不大，客观上为HRVA的繁殖和传播提供了一个相对适宜的环境，也是春季检出率偏高的主要原因之一。

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Rotavirus A pathogen surveillance and gene typing analysis in Henan Province from 2012 to 2015

ZhaoJiayong,ShenXiaojing,ZhangBaifan,HuangLili,XiaShengli,HuangXueyong,XuBianli

InstituteforInfectiousDiseaseControlandPrevention,HenanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhengzhou450016,China

XuBianli,Email:xubl@hncdc.com.cn

ObjectiveToanalyzingtheinfectiousstatusandetiologicalcharacteristicsofrotavirusAfromchildrenlessthanfiveyearsoldinHenanprovincefrom2012to2015,toprovidebaselinedataandmethodological

forthediseasesurveillence,andcontroloutbreakcasesinvestigationsaswellasvaccineresearchanddevelopment.Methods1 433stoolsampleswerecollectedfromchildrenlessthanfiveyearsoldintwosentinelhospitalsandtransportedtolaboratoryinminustwentydegreesanddetectedgroupArotaviruspathogensbydoubleantibodysandwichELISAmethod.ViralRNAwasextractedfrompositivesamplesandmadeG/Pgenetypingwascontinuedwithtwo-stepnestedmultiplexRT-PCR.Results482positivesamplesofgroupArotavirusweredetectedfrom1 433diarrheasamplesandthetotalpositiveratewas33.6%,thereweretwoseasonaldetectionpositiveratepeakswithautumn(9-11months)andspring(3-5months).GtypingofgroupArotavirusweremainlyG1,G2,G3,G9;PtypingweremainlyP[4], [8];genetypecombinationwerecomposedmainlyofG9P[8],G2P[4],G3P[8],G1P[8]withexistingmixedinfectiontype.IngroupArotavirusinfectionssamples,sexratiowas1.4:1 (male279/female203);positivecasesweremainlyfocusedon4-12monthsoldinfantpatients(65.4%, 315/482)andtheinfectionrateinruralareaswashigherthanthatinurbanareas;clinicalsymptomsweremainlymild-to-moderatediarrheaandsomecaseshadfever,vomiting,dehydrationandotherphenomena.ConclusionsThereexistedratherhighinfectionrateofgroupArotavirusinacutediarrheachildrenlessthan5yearsoldinHenanprovinceincludingpartmixedinfectioncases,mainlyinautumnandspringannually,whichcanbedividedintoavarietyofgenotypes,G9P[8]wasthedominanttype;mostinfectedcasesshowedmilddegrees.

Rotavirus;Genotyping;Clinicalfeatures

许汴利，Email: xubl@hncdc.com.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.004

轮状病毒属；基因型；临床特征

十二五科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项”(2013ZX10004203； 2012ZX10004215)；河南省科技攻关课题“细菌性病原体分子分型与网络化溯源技术应用研究(152102310133)”

2016-03-10)