上海地区人博卡病毒在儿童急性呼吸道感染的研究

宋靖荣 高寒春 林珍 亢娟 叶剑敏 杨子珍 谢志萍

201900 上海交通大学医学院附属第九人民医院儿科(宋靖荣、林珍、亢娟)；100052 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(高寒春、谢志萍)；201900 上海交通大学医学院附属新华医院(叶剑敏)；201900 上海普陀区中心医院(杨子珍)



·论著·

上海地区人博卡病毒在儿童急性呼吸道感染的研究

宋靖荣 高寒春 林珍 亢娟 叶剑敏 杨子珍 谢志萍

201900 上海交通大学医学院附属第九人民医院儿科(宋靖荣、林珍、亢娟)；100052 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(高寒春、谢志萍)；201900 上海交通大学医学院附属新华医院(叶剑敏)；201900 上海普陀区中心医院(杨子珍)

宋靖荣、高寒春为共同第一作者

目的 了解上海地区人博卡病毒(HBoV)在儿童急性呼吸道感染中的流行情况和临床特点。方法 上海地区在2012年1月至2012年12月共收集271例急性呼吸道感染患儿的鼻咽抽吸物，采用巢式聚合酶链反应(Nested PCR)方法检测人博卡病毒NS1基因、并经测序确认，对所获得的基因序列进行同源性和进化分析，博卡病毒阳性样本同时检测鼻病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等8种呼吸道相关病毒。结果 271例标本中共检出HBoV阳性31例，检出率11.4%；21例存在混合感染，全年均有检出，阳性患儿中位年龄17个月(4个月-4岁)，诊断包括上呼吸道及下呼吸道感染，临床表现包括发热、阵发性咳嗽、咳痰、腹泻、呕吐、咽充血、湿罗音等，无死亡病例，门诊患者检出率明显高于住院患者；序列分析表明其中29例为HBoV1、2例为HBoV2、与参考株的核苷酸同源性为99%-100%，氨基酸同源性96%-100%。结论 HBoV1是上海地区急性呼吸道感染患儿中的重要病原，HBoV2在该地区首次检出，临床症状及诊断无特异性。

Fund programs: National Natural Science Foundation of China(81100005)

急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection ARTI)是儿童常见疾病，是引起死亡的常见原因，除目前公认的呼吸道合胞病毒，流感病毒，副流感病毒，腺病毒，鼻病毒，冠状病毒外，仍有约60%儿童的急性呼吸道感染，虽然被认为是由于病毒引起，但其确切的病原尚未阐明。瑞典学者Tobias Allander在2005年通过对儿童急性呼吸道感染样本大规模采用随机PCR扩增测序和生物信息学结合的方法进行筛查，发现了新的细小病毒，人博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)[1]。随后在世界范围引起重视，据报道呼吸道标本的HBoV DNA阳性检出率为0．8%-19 %，并在血清，粪便及尿液标本中均有检出[2-4]，并有证实HBoV感染与儿童急性呼吸道感染有关[4]。目前将Allander发现的人博卡病毒称为HBoV1，后来报道的与HBoV亲缘关系相近的三种病毒分别命名为人类博卡病毒2，3,4(HBoV2,3,4)。本课题组前期已证实HBoV1在兰州地区呼吸道标本中存在，并首先检出HBoV2[5]，近期在兰州呼吸道标本中又发现有HBoV3的检出[6]。但HBoV4尚未在呼吸道标本中检出。为更好了解HBoV在我国分布及流行特点，我们收集上海地区2012年1月至2012年12月急性呼吸道感染儿童的鼻咽抽吸物标本，探讨该地区HBoV的分子流行病学及临床特点。

1 材料与方法

1.1 标本收集 收集2012年1月至2012年12月因急性呼吸道感染在上海交通大学附属第九人民医院，上海交通大学附属新华医院，上海市普陀区中心医院就诊的患儿的鼻咽抽吸物标本，共271份，急性呼吸道感染诊断符合《诸福棠实用儿科学》第7版。所有患儿于就诊当日采集标本，方法参见文献[5]，采集过程均告知患儿家属并征得同意。本研究经医院伦理委员会同意。

1.2 研究方法

1.2.1 样本处理：快速溶解鼻咽分泌物样本，置于漩涡振荡器上充分震荡混匀，1 500×g离心10 min，提取样本核酸(德国Qiagen公司)进行病毒检测，操作过程均按说明书进行。

1.2.2 HBoV核酸检测：合成针对HBOV病毒非结构蛋白NS1基因的特异性引物,采用巢式PCR方法进行扩增，实验引物及反应条件参见文献[5]。引物由英俊生物公司(北京)合成，每次PCR反应均设阳性(HBoV阳性质粒)及阴性(无菌水)对照，产物用琼脂糖凝胶(1.5%)电泳进行鉴定。exTaq 酶为日本TaKaRa 公司产品。

1.2.3 序列测定及分析：扩增阳性产物送北京擎科新业生物技术有限公司进行序列测定，所用引物为通用引物。所测得的序列与GenBank 中细小病毒科其他成员及已发现的HBoV基因序列进行比较分析。序列比较和进化分析所用到的基因序列在Genbank中的序列号为EU984232, EF450717, DQ000496, DQ000495, FJ170279，FJ170282, NC001540, NC004442, NC000883,EU918736.1,FJ973561.2。

1.3 混合感染分析 HBoV阳性标本通过文献[5]所报道的RT-PCR或PCR方法，进行流感病毒(IFV)、副流感病毒(PIV)，冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、冠状病毒NL63( HCoV-NL63)、偏肺病毒(HMPV)等其他常见呼吸道病毒检测，了解混合感染的情况。

1.4 临床资料分析 患儿临床资料由本课题组医生统一登记，根据检测结果进行HBoV的临床及流行病学分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0进行统计学分析，计数资料采用Chi-square检验或校正Chi-square检验,计量资料采用秩和检验。

2 结果

图1 HBV上海株(SH)与HBoV标准株EU984232, EF450717, DQ000496, DQ000495,FJ170279,FJ170282,NC001540,NC004442,NC000883,EU918736.1,FJ973561.2基于NS1基因部分序列亲缘性关系树 Fig.1 Phylogenetic trees based on the partial nonstructural protein 1(NS1) nucleotide sequences of human bocavirus in this study and those of reference strains(EU984232, EF450717,DQ000496, DQ000495,FJ170279,FJ170282, NC001540,NC004442,NC000883,EU918736.1,FJ973561.2) form GenBank

2.1 HBoV基因检测结果及序列分析 271例NAPs样本中有31例检测阳性，将测序结果在美国生物医学信息中心(NCBI)GeneBank中多株已知HBoV序列进行Blast比较,结果显示29例阳性样本与HBoV1属于同一进化簇，其氨基酸同源性在96%-100%之间，核苷酸同源性在99%-100%之间，2例(SH137,SH212)与HBoV2标准株FJ170282的核苷酸同源性分别为99%，氨基酸同源性99%，属同一进化簇，未发现HBoV3，HBoV4。进一步系统进化分析结果见图1。

2.2 混合感染的检测结果 出的29例HBoV1阳性标本中19例为混合感染，10例为单独HBoV感染，混合感染率65.5%，其中有14例同时感染1种病毒(3例ADV,2例RSV，4例HRV，3例PIV3,2例PIV4)，5例同时感染2 种病毒(2例ADV+PIV3，1例ADV+PIV4,1例ADV+HRV，1例HRV+PIV4)。 2例HBoV2均同时感染PIV3及ADV。

2.3 流行病学分析 全年共收集鼻咽抽吸物样本271例，男性181例，女性90例；男女之比为2∶1,共检出阳性31例，检出率11.4%(31/271)；其中HBoV1的检出率为10.7%(29/271)，阳性患儿中男性23例，女性8例，男女检出率之间差异无统计学意义(χ2=0.865，P>0.05)；阳性患儿中位年龄17个月(4个月-4岁)，其中12-23月患儿检出率最高，大部分集中在6个月到2岁，各年龄组检出分布见图2。各年龄组间有统计学意义(χ2=15.25，P<0.05)，HBoV在研究年中各月均有检出，7月检出率最高，具体分布见图3。其中门诊样本120例，住院样本151例，门诊患儿检出24例(20.0%)，住院患儿中检出7例(4.6%)，门诊和住院患儿检出率之间有差异统计学意义(χ2=15.58，P<0.05)。

图2 人博卡病毒阳性患儿年龄分布Fig.2 Age of HBoV in children with actue respiratory tract infection

图3 人博卡病毒阳性患儿时间分布图Fig.3 Seasonal distribution of HBoV in children with actue respiratory tract infection

2.4 HBoV患儿感染临床特征 29例HBoV1阳性患儿临床诊断包括8例上呼吸道感染和21例下呼吸道感染，其中诊断为上呼吸道感染7例，扁桃体炎1例，支气管炎11例，支气管肺炎7例，肺炎2例，毛细支气管炎1例。患儿中9例发热，平均热程2.7 d，咽充血29例，咳嗽28例，咯痰12例，鼻塞流涕等卡他症状17例，发绀1例，19例肺部有湿啰音，其中4例有哮鸣音。部分患儿伴有腹泻(4例)、呕吐(3例)。无死亡病例。6例住院患儿，住院天数4-10 d，平均天数为 6.8 d。HBoV阳性患儿中2例有基础疾病者.均为先天性心脏病。

2例HBoV2患儿感染特征如下：SH137:男性，36个月，2012年8月发病，合并感染ADV,诊断为支气管肺炎，住院治疗11 d，治愈出院，临床症状有发热(39.5 ℃)，咳嗽，咳痰，咽充血，流涕，肺部湿啰音。SH212:女，12个月，2012年11月发病，合并感染PIV3,诊断为急性上呼吸道感染，门诊治疗5 d，治愈，临床症状有咳嗽，咽充血，流涕。

3 讨论

人博卡病毒(HBoV)属于细小病毒科，细小病毒亚科，博卡病毒属，为线性单链DNA(ssDNA)，是除B19细小病毒和人细小病毒4(PARV4)外，被发现的与人类疾病相关的细小病毒之一，目前HBoV已分为1-4型，其在世界各国广泛流行，世界各地均有报道在呼吸道、肠道、血清及尿液标本中检出HBoV，其中HBoV1，HBoV2和HBoV3在呼吸道及肠道标本中均有检出，HBoV4仅在肠道标本中检出。

综合前期相关研究，HBoV1在许多国家已被检测到，呈世界范围流行，在我国，多地区也有HBoV1的流行病学报道，检出率在1.4%-19%不等，大多数感染HBoV1的儿童年龄<2岁，一年四季均可发生，未表现出明显的季节分布，临床诊断以肺炎居多，同时可能伴有腹泻，与其他呼吸道病毒混合感染较常见[7]，我们的研究表明，在本研究年中，上海地区HBoV1的检出率为10.7%，高于上海2006-2008年的检出率[8]，同时也高于兰州，天津，南京的检出率[6，9，10]，与韩国[11]相仿，与文献报道多发生在冬春季节不同，本研究检出以夏秋季节为主，年龄在6个月至2岁的儿童阳性率最高，与年龄小于6个月及两岁以上的儿童相比有统计学意义，与上海地区既往研究不同[8]，而这种年龄分布可能与生后6个月前有母亲胎传的免疫保护及随年龄增加逐渐增强的细胞免疫有关。大部分HBoV1为下吸呼道感染，混合感染率65.5%，ADV是混合感染的主要病毒，HBoV1感染患儿的临床表现主要为阵发性咳嗽，发热等，X胸片改变无特殊，一些研究报道HBoV1与重症肺疾病及儿童喘息密切相关[4]，本研究中我们发现门诊的感染率明显高于住院患者，差异有统计学意义，说明可能HBoV感染后临床症状较轻，并且本研究中29例HBoV1患者中，4例出现喘息症状，其中3例为混合感染，分别是RSV,PIV3，ADV+PIV3各1例，故暂不能说明与喘息有关。

2009年Arthur在粪便标本中发现HBoV2后[12]，本课题组继而从呼吸道标本中检出HBoV2[5],后续研究显示HBoV2型在儿童粪便标本中检出率较高，呼吸道标本中检出率低，且阳性患者较多出现胃肠道症状[7]，兰州地区既往研究显示，急性呼吸道感染儿童的呼吸道标本中HBoV2的检出率0.38%-4.2%，且均有腹泻症状及混合感染[6]，本研究在上海地区呼吸道鼻咽分泌物标本中检出HBoV2 两例，检出率0.7%，年龄均<2岁，在夏秋季发病，均同时感染PIV3及ADV,诊断包括上呼吸道及下呼吸感染，临床表现与HBoV1无殊，均无腹泻，无喘息，由于阳性标本少，需要后期更大样本及长期的流行病检测了解HBoV2的流行情况。

HBoVs作为一种新出现的病原体，从HBoV1到HBoV4的发现提示不同地区流行的病毒株的核苷酸序列有较高的多样性。HBoV1与HBoV2的氨基酸同源性为67%-8O%，HBoV3被认为可能是来自HBoV1和HBoV2的重组株；同样，HBoV4被认为是由HBoV2和HBoV3结构蛋白编码区重组产生[7]。目前不排除我国HBoV存在重组和变异的可能，而病毒重组可导致病毒抗原性变异，引起大流行，因此对我国HBoV的分子流行病进行长期监测有着重要意义。我们采用巢式PCR方法扩增HBoV NS1片段，共检出31例HBoV，经测序分析并与已公布的标准株序列同源性在99%-100%之间，氨基酸序列同源性在96%-100%之间，确定为人博卡病毒，进一步系统进化分析结果提示，29例阳性标本属于HBoV1,2例属于HBoV2，与既往上海地区不同，我们首次在上海地区检出HBoV2，但未检出HBoV3和HBoV4。

通过对上海地区急性呼吸道感染患儿呼吸道分泌物中HBoV基因的检测和分析证实，上海地区HBoV流行已HBoV1为主，同时首次发现有HBoV2出现，由于发现HBoV时间不长，本研究为回顾性研究，时间段较为局限，临床较难设置正常对照组等不足，仍需要更广泛深入研究更好了解其与儿童急性呼吸道感染相关性及感染后临床严重程度等问题，同时了解HBoV在儿童急性呼吸道感染中的病原学及流行病学规律。

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Molecular epidemiological and clinical features of human bocavirus in children with acute respiratory tract infection in Shanghai.

SongJingrong,GaoHanchun,LinZhen,KangJuan,YeJianmin,YangZizhen,XieZhiping

ShanghaiNinthPeople’sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,DepartmentofPediatrics,Shanghai201900,China(SongJR,LinZ,KangJ);NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100052,China.(GaoHC,XieZP);XinhuaHospitalAffiliatedtoMedicineSchoolofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai201900,China(YeJM);ShanghaiPutuoDistrictCentralHospital,Shanghai201900,China(YangZZ)

SongJingrongandGaoHanchunarethefirstauthorswhocontributedequallytothearticle

SongJingrong,Email:songyang92006@163.com,XieZhiping,Email:xiezhiping@126.com

Objective To investigate the molecular epidemiology and clinical characteristics of human bocavirus in children with acute respiratory tract infection in Shanghai, China. Methods Between January 2012 and December 2012, 271 nasopharyngeal aspiration (NPA) samples were collected from children who had been hospitalized for acute respiratory tract infection at Shanghai, China. HBoV NS1 gene was detected by the nested polymerase chain reaction.In the further, other common respiratory viruses (HRV,RSV, ADV et al) was screened in HBoV positive samples, All PCR positive products were sequenced and phylogenetic analysis. Results The overall frequency of HBoV, infection was 11.4%. 21of 31 HBoV positive sample tested were mix-infection. HBoV was detected from all over year. Children with HBoV varied in age from 4 months to 4-years (median age,17 months).The clinical diagnoses of HBoV positive patients included acute upper respiratory tract infection and lower respiratory tract infection. The clinical presentations of HBoV positive children included fever, cough, sputum production, diarrhea, vomiting; pharynx engorgement, crackles, wheezing. There being a statistically significant difference in the detection rates of HBoV between the outpatients and inpatients. The HBoV NS1 gene sequences phylogenetic analysis revealed that 29 HBoV1 NS1 sequences shared 99%-100% nucleotide identity with the human bocavirus strain, whereas the amino acid identity was 96%-100%. The two HBoV2 NS1 sequences shared 99% nucleotide sequence identity with HBoV2 strain FJ170282 respectively. Conclusions Human bocavirus was distributed in Shanghai region, HBoV1 was dominant and HBoV2 was detected at the first time. The symptom and clinical diagnoses has no specificity with patients with other common respiratory viruses.

Respiratory tract infection; Human bocavirus; Epidemiology; Child

宋靖荣Email: songyang92006@163.com;谢志萍 Email：xiezhiping@126.com；

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.009

呼吸道感染；人博卡病毒；流行病学；儿童

国家自然科学基金(81100005)

2016-01-16)