沙棘果油提取工艺的正交试验优化及其脂肪酸组分测定

丁 健，关 莹，阮成江，单金友，包怡红，吴雨蹊

（1.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.大连民族大学资源植物研究所，辽宁 大连 116600；3.黑龙江省农业科学院浆果 研究所，黑龙江 绥棱 152200）

沙棘果油提取工艺的正交试验优化及其脂肪酸组分测定

丁 健1,2,3，关 莹3，阮成江2，单金友3，包怡红1,*，吴雨蹊3

（1.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.大连民族大学资源植物研究所，辽宁 大连 116600；3.黑龙江省农业科学院浆果 研究所，黑龙江 绥棱 152200）

利用超声波辅助索氏提取技术对沙棘果肉提取工艺进行优化，并采用气相色谱-飞行时间质谱技术，考察果油脂肪酸组分。通过进行提取温度、回流时间、料液比、超声时间4 个因素的单因素试验和正交试验，结果表明：沙棘果油的最佳提取条件为料液比1∶70（g/mL）、提取温度55 ℃、超声辅助提取30 min、索氏提取回流时间6 h，沙棘果油提取率为28.14%，其中共检测出24 种脂肪酸，其中主要包括棕榈油酸和棕榈酸，相对含量分别为35.56%和59.37%。因此利用超声波辅助索氏法提取沙棘果油，可以为医药和工业生产提供更优质和丰富的原材料。

沙棘果油；超声波；索氏提取；气相色谱-飞行时间质谱；脂肪酸

沙棘（Hippophae L.）为胡颓子科沙棘属植物，多年生落叶灌木或小乔木，适应性强，能显著改善生态环境[1]，其果实中含有丰富的天然活性成分，具有良好的药用及保健价值[2-3]。沙棘油是沙棘果实中的最有价值的组分之一，对心脑血管、胃肠道、肝脏、皮肤组织等具有保护及修复作用，其中多不饱和脂肪酸ω-3和ω-6都是人体不能自身合成的脂肪族，ω-7脂肪酸（尤其棕榈油酸，C16∶1）具有重要的工业、营养和医药价值，是珍稀的天然脂肪酸[4]。

沙棘的含油量与（亚）种、生长环境、采摘时期、提取方法等相关[5-7]，种子含油量约为7%～11%，非种子组织（鲜果肉和果皮）含油量约为1%～6%[8]。另外沙棘果中还含有抗坏血酸（VC）、生育酚、生育三烯酚、类胡萝卜素等多种生物活性物质[9-14]，其中每100 g沙棘果中含VC 800～2 100 mg，是猕猴桃的2～8 倍[15]。目前常用的提取沙棘果油的方法主要有压榨法、溶剂浸提法、超临界萃取法等[16]。压榨法出油率低，非脂溶性活性物质浸出不完全。一般溶剂浸提法存在提取时间长、温度高等缺点[17]，其中索氏提取沙棘果油得率为13.2%～20.8%[18-19]。超临界流体萃取法设备昂贵，且受超临界流体、压力和温度等对物质溶解度的局限[20]。超声波辅助浸提法具有操作简单、浸提温度低、提取率高、提取时间短等优点[21]，其应用在沙棘果渣中仍可获得7.49%的粗油[19]，另外在沙棘的总黄酮提取中也报道[22]。

由于提取方法的不同，油脂中的组分也存在一定的差异，脂肪酸含量是考察油脂品质的指标之一，有研究学者检测出沙棘果肉和种子中共含有35 种脂肪酸[23]，但大多数学者主要研究C16和C18脂肪酸的变化[24-26]，果肉主要积累C16∶0（棕榈酸，39.11%）和C16∶1（棕榈油酸，26.72%），而种子主要积累C18∶2（亚油酸，33.72%）和C18∶3（亚麻酸，31.81%）[20]。有研究认为沙棘果油的生物活性要优于沙棘籽油，其非皂化质中各类成分108 种，是籽油的2 倍多[27]，而且沙棘果肉中高积累棕榈油酸的特性在自然界中罕见，其油脂的液相中可富集53%的棕榈油酸，而沙棘果渣中仍含有15%棕榈油酸[4,28]，其可减少人体胆固醇含量、增加细胞膜的流动性、防止心率失常和抑制肿瘤[29]。另外，沙棘果油为深棕色，在常温条件下其稳定性优于籽油，但在低温下常呈固体状；另外，沙棘果油还含有特殊的芳香气味，是区别于籽油的重要特征[27]。

本研究旨在利用超声波提取省时及索氏提取率高的特点，对超声波辅助索氏提取沙棘果油工艺进行优化，确定最佳沙棘果油提取工艺条件，采用气相色谱-飞行时间质谱（gas chromatography coupled with time-of-flightmass spectrometry，GC-TOF-MS）技术对沙棘果油中的脂肪酸组分进行定性和定量，旨在为高效利用沙棘果油这一生物质能源提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙棘果为2014年8月中旬采于黑龙江省沙棘工程技术中心，用干冰运输，-55 ℃保存；石油醚（30～60 ℃）、氯化钠、氢氧化钾（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；三氟化硼-甲醇溶液、脂肪酸甲酯标准品 美国Sigma公司；甲醇、正己烷（均为色谱纯） 美国Honeywell公司。

1.2 仪器与设备

Clarus 680 GC和AxION iQT串联MS 美国PerkinElmer公司；DB-23气相色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；FreeZone冷冻干燥机美国Labconco公司；SB-5200D超声波仪 宁波新艺超声设备有限公司；LABOROTA 4000旋转蒸发仪 德国Heidolph公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘果油提取工艺流程

沙棘果→分离果肉和种子→液氮研磨果肉→冷冻干燥至质量恒定→准确称质量严密包装（含水量＜5%）→放入广口瓶后添加石油醚称质量→超声波提取后称质量，补足石油醚→全部转入索氏提取管→索氏提取后过滤石油醚→55 ℃旋转回收石油醚40 min→烧瓶室温条件下（±25 ℃）放置24 h至质量恒定→差量法称质量，计算沙棘果油提取效率，每组实验重复3 次，采用最小显著性差异方法对单因素试验进行方差分析。

1.3.2 沙棘果油提取率的计算

式中：R为沙棘果油提取率/%；m1为沙棘果油和接收瓶的质量/g；m2为接收瓶的质量/g；m为沙棘果肉干粉质量/g。

1.3.3 沙棘果油提取的单因素试验

在前期实验的基础上，称取4.0 g沙棘果肉干粉，在超声功率200 W、超声频率40 kHz条件下，石油醚为提取溶剂，在提取温度45、50、55、60、65 ℃，回流时间4、6、8、10、12 h，料液比1∶30、1∶50、1∶70、1∶90（g/mL），超声时间0、10、20、30、40、50 min，进行单因素试验，研究这4 个因素对沙棘果油提取率的影响，均设置3 次重复。

1.3.4 沙棘果油提取的正交试验

以单因素试验结果为基础，选取回流时间、超声时间、料液比、提取温度4 个因素设计正交试验，每个因素设置3 个水平，研究其对沙棘果油提取率的影响，重复2 次。正交试验方案见表1。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels used in the orthogonal array design

1.3.5 沙棘果油脂肪酸的GC-TOF-MS检测

1.3.5.1 实验材料处理

沙棘果油的脂肪酸检测包括3 份不同提取方法的样品：Ⅰ. 超声波辅助索氏提取样品，即1.3.4节中最优提取工艺（回流时间6 h、超声时间30 min、料液比1∶70、提取温度55 ℃）获得的果油；Ⅱ. 超声波法提取样品，即超声30 min，料液比1∶70条件下获得的果油；Ⅲ. 索氏提取样品，即回流时间6 h、料液比1∶70、提取温度55 ℃条件下获得的果油。

1.3.5.2 甲酯化

沙棘油常采用碱催化法进行脂肪酸的甲酯化[19,27,30]。甲酯化方法根据彭密军等[30]的方法，并做适宜改进。取20 mg沙棘果油于具塞试管中，加入2 mL正己烷和5 mL的1 mol/L KOH-甲醇溶液，振荡溶解样品，于60 ℃水浴30 min后，加入10 mL三氟化硼-甲醇溶液，再于60 ℃水浴30 min，冷却后，加入2 mL饱和氯化钠和2 mL正己烷，静置分层后，收集上清液，加入少量无水硫酸钠干燥，上清液过0.2 μm微孔滤膜后入样品瓶，-20 ℃冷藏备用。

1.3.5.3 气相色谱质谱条件及数据分析

采用DB-23色谱柱，进样口温度230 ℃，载气流速1 mL/min，进样量1 μL，分流比20∶1。柱箱升温程序：50 ℃以15 ℃/min升至200 ℃，保持15 min；以3 ℃/min升温至215 ℃，保持10 min；以3 ℃/min升温至230 ℃，保持5 min。电子电离源温度230 ℃，传输线温度245 ℃，检测电压1 400 V，溶剂延迟5 min，质量扫描范围45～400 u。根据37 种脂肪酸甲酯标准品建立质谱库进行样品的定性，应用峰面积归一法进行沙棘果油脂肪酸的相对定量。

2 结果与分析

2.1 提取条件的单因素试验结果

2.1.1 提取温度对沙棘果油提取率的影响

图1 提取温度对提取率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction yield

在料液比1∶50、超声时间20 min、回流时间10 h的条件下，不同提取温度对提取率的影响见图1。随着提取温度升高，提取率也逐渐升高，30～60 ℃沸程的石油醚随着温度升高，在索氏提取设备中回流速率加快，果油的萃取、渗透速率随之加快，致使虹吸次数增多，油脂抽提更接近完全，除60 ℃处理外，65 ℃处理与其他处理均存在显著性差异，但相对高的温度更易导致石油醚过沸和损失，因此选择50～60 ℃为沙棘果油提取温度范围。

2.1.2 索氏回流时间对沙棘果粉提取率的影响

图2 回流时间对提取率的影响Fig. 2 Effect of refluxing time on extraction yield

如图2所示，在提取温度60 ℃、超声时间20 min、料液比1∶60的条件下，索氏提取回流时间在4～8 h时，回流次数明显增多，果油提取率升高迅速；在8～12 h，提取率增速趋于平缓，8 h之后提取率差异不显著。有效物质从细胞内溶解到细胞外，达到浓度平衡需要一定的时间，在达到平衡之前，提取时间越长，脂溶性物质溶出越多，达平衡后，提取时间的延长会导致其他杂质溶出[31]。从节省时间考虑，选择回流8 h为最优提取时间。

2.1.3 料液比对沙棘果油提取率的影响

图3 料液比对提取率的影响Fig.3 Effect of ratio of material to solvent on extraction yield

在提取温度60 ℃、超声时间20 min、回流时间8 h的条件下，不同料液比对提取率的影响见图3。随着溶剂用量的降低，沙棘果油提取率逐渐升高，溶剂用量过高或过低都不能对果粉中的油脂进行充分提取。当料液比为1∶70时果油的提取率为27.53%，之后又趋于稳定，其与1∶30、1∶50处理存在显著性差异，但与1∶90处理差异不明显。这是溶剂的增多，溶解油脂更充分，因此料液比过大提取物的不能充分溶解于溶剂中，提取率低，但料液比过小则溶剂利用率低，造成浪费和污染。因此最佳料液比为1∶70（g/mL）。

2.1.4 超声时间对沙棘果油提取率的影响

图4 超声时间对提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonication time on extraction yield

如图4所示，随着超声时间的延长，提取率先迅速提高，后逐渐趋于平缓。在料液比1∶70、提取温度60 ℃、回流时间8 h的条件下，超声辅助提取10～30 min时，提取率迅速上升，之后缓慢上升，50 min左右趋于平缓，30、40、50 min处理与10、20 min处理差异显著，但30～50 ℃处理之间无差异显著性。利用超声波技术将果粉中的油脂迅速溶出到提取溶剂中，超声30 min后，提取溶液体系的渗透压趋于平衡，导致提取率也趋于稳定，因此选取最佳超声时间为30 min。

2.2 沙棘果油提取条件的正交试验优化

由于回流8 h与10 h的沙棘果油提取率差异不显著，为了节省提取时间，设置4、6、8 h回流时间进行正交试验。正交试验结果如表2、3所示，影响沙棘果油提取率的各因素主次顺序为C＞D＞B＞A。因素C的P＜0.01，且极差R值大于其他三因素，说明料液比对指标影响最大；因素D的P＜0.05，即提取温度对试验结果影响显著；因素A、B对结果有一定影响。各主次指标最高水平，组成较优工艺条件为A2B3C2D2，即回流时间6 h、超声时间30 min、料液比1∶70、提取温度55 ℃为最佳提取工艺组合。

表2 正交试验提取优化结果Table 2 Orthogonal array design with experimental results foroptimization of extraction process

表 3 正交试验方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal experimental results

2.3 验证实验

在索氏提取回流时间6 h、超声时间30 min、料液比1∶70、提取温度55 ℃条件下，进行3 次平行实验，沙棘果油提取率分别为28.10%、28.19%和28.12%，平均提取率为28.14%，因此确定A2B3C2D2为最佳提取方案。

2.4 沙棘果油脂肪酸的GC-TOF-MS检测结果

利用DB-23极性色谱柱将37 种脂肪酸甲酯物质完全分离（图5A），应用超声波索氏提取法（图5B）、超声波提取法（图5C）和索氏提取法（图5D）的沙棘果油分别均检测出24 种脂肪酸甲酯（表4），其中棕榈酸（C16∶0）和棕榈油酸（C16∶1）是沙棘果油的主要脂肪酸，超声波索氏提取法、超声波提取法和索氏提取法的棕榈酸的相对含量分别为59.37%、64.28%和70.66%，棕榈油酸的相对含量分别为35.56%、30.76%和26.91%。陈笑莹等[32]研究表明应用索氏提取法可检测到21.66%的棕榈油酸，而超声波提取法仅检测到18.41%的棕榈油酸。棕榈酸具有增加人体胆固醇和中性脂肪，防止血管变脆、脑出血等作用，而棕榈油酸有降低无宜胆固醇，提高有益胆固醇比例的功效，有预防动脉硬化的作用。可以看出超声波辅助索氏提取法中的棕榈油酸与棕榈酸的相对比例最高，其对人体健康更加有益[17]。另外超声波辅助索氏提取法的单不饱和脂肪酸相对含量最高，明显高于其他2 种方法。

图5 脂肪酸甲酯色谱图Fig.5 Chromatograms of fatty acid methyl esters

表4 沙棘果油主要脂肪酸组成与相对含量Table 4 Fatty acid components and relative contents of sea buckthornfruit oil

3 结 论

索氏提取法是经典的油脂提取方法，在其方法上的改进可有效提高油脂利用率和改善脂肪酸比例，相关研究指出利用超声波法提取植物性油脂不仅可以提高有效成分的提取率，避免主要生物成分的生理活性的损耗，而且可以增加其在油脂中的含量[33]。通过超声波辅助索氏提取法对沙棘果油的提取工艺进行优化，得出料液比对沙棘果油提取率的影响最大，优化得到沙棘果油最佳提取条件：在超声功率200 W、超声频率40 kHz、回流时间6 h、超声时间30 min、料液比1∶70（g/mL）、提取温度55 ℃条件下，沙棘果油的提取率可达28.14%，应用碱催化法在沙棘果油中检测到24 种脂肪酸，棕榈油酸含量为35.56%，该方法的提取率明显高于有机溶剂萃取法（4.1%～8.9%），而棕榈油酸含量（31.4%～36.8%）相近[34]，另外超声波辅助索氏提取法的果油提取率还明显高于一些新技术方法，如分子蒸馏法（19.3%）、复合酶解法（4.95%）和超临界CO2萃取法（5.82%），而检测到的棕榈油酸含量相似[35-38]。由此可见，应用超声波辅助索氏提取法可以高效利用沙棘果油，应用GC-TOF-MS方法不仅检测出高含量的棕榈油酸和棕榈酸，它们在化妆品、医药保健品和工业用品生产中具有重要作用，而且检测到微量的DHA（C22∶6），其是神经系统细胞生长及维持的重要元素。在当今能源逐渐匮乏，优质生产资料短缺的形式下，高效利用生物质能源越发成为研究热点，利用超声波辅助索氏提取沙棘果油，可低成本、高时效的为生产和开发提供优质原材料，并为高效利用和生产高品质沙棘果油提供技术参考。

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Optimization by Orthogonal Array Design of Sea Buckthorn Fruit Oil Extraction and Determination of Fatty Acid Composition

DING Jian1,2,3, GUAN Ying3, RUAN Chengjiang2, SHAN Jinyou3, BAO Yihong1,*, WU Yuxi3
(1. College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2. Institute of Plant Resources, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, China; 3. Institute of Berries, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Suiling 152200, China)

The ultrasound-assisted Soxhl et extraction of sea buckthorn oil from dry pulp was optimized by orthogonal array design, and the fatty acid composition and contents of sea buckthorn pulp oil were determined by gas chromatography (GC) coupled with time-of-flight mass spectrometry (TOF-MS). Using combination of single-factor and orthogonal experiments, the optimal conditions for sea buckthorn fruit oil extraction were as follows: solid/solvent ratio, 1:70 (g/mL); ultrasonicassisted extraction time, 30 min; extraction temperature, 55 ℃; and Soxhlet reflux extraction time, 6 h. Under the optimized conditions, the yield of sea buckthorn oil from dry pulp was 28.14%. Twenty-four fat ty acids were detected from the oil, and the main fatty acids palmitoleic and palmitic acid were 35.56% and 59.37%, respectively, which are widely used in chemical, health products and cosmetics. Therefore the sea buckthorn fruit oil extracted by the ultrasound-assisted Soxhlet extraction method can provide a high-quality, abundant raw material for medicine and industrial production.

sea buckthorn pulp oil; ultrasonic; Soxhlet extraction; gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry (GC-TOF-MS); fatty acids

10.7506/spkx1002-6630-201602003

S663.9

A

1002-6630（2016）02-0013-06

丁健, 关莹, 阮成江, 等. 沙棘果油提取工艺的正交试验优化及其脂肪酸组分测定[J]. 食品科学, 2016, 37(2): 13-18. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602003. http://www.spkx.net.cn

DING Jian, GUAN Ying, RUAN Chengjiang, et al. Optimization by orthogonal array design of sea buckthorn frui t oil extraction and determination of fatty acid composition[J]. Food Science, 2016, 37(2): 13-18. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201602003. http://www.spkx.net.cn

2015-06-02

国家自然科学基金面上项目（31570681）

丁健（1983—），男，助理研究员，博士研究生，研究方向为植物活性成分利用与分子育种。

E-mail：mervyntin2901@aliyun.com

*通信作者：包怡红（1970—），女，教授，博士，研究方向为天然产物活性成分生物转化和食品生物技术。

E-mail：baoyihong@163.com