鲨鱼软骨多糖中硫酸角质素分离方法研究

李燕妮，曹红光，郭琳，许维娜

（1.滨州医学院葡萄酒学院，山东烟台264003；2.烟台东诚药业集团股份有限公司，山东烟台264006）

鲨鱼软骨多糖中硫酸角质素分离方法研究

李燕妮1，曹红光2，郭琳1，许维娜1

（1.滨州医学院葡萄酒学院，山东烟台264003；2.烟台东诚药业集团股份有限公司，山东烟台264006）

探索简单有效的分离和检测鲨鱼软骨多糖中硫酸角质素组分的方法。使用乙醇分级沉淀法分离多糖中硫酸角质素，使用硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量，MonoQHPLC法测定硫酸角质素含量。：硫酸角质素从多糖中分离的条件：氯化钠浓度为2.0％，乙醇浓度小于56％时；氯化钠浓度为1.5％，乙醇浓度小于58％时；氯化钠浓度为1.0％，乙醇浓度小于60％时。使用乙醇分级沉淀法可实现鲨鱼软骨多糖中硫酸角质素组分的分离，MonoQHPLC法可简单快速检测多糖中硫酸角质素组分。

鲨鱼软骨多糖；硫酸角质素；MonoQ；分离

软骨多糖主要包括硫酸软骨素、硫酸角质素等成分［1-2］。鲨鱼硫酸软骨素是目前市售硫酸软骨素的重要组成部分［3］。硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate，CS）为糖胺聚糖类大分子酸性多糖，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺（GlcA-GalNAc）以β-1，3糖苷键连接形成二糖，二糖单位之间以β-1，4糖苷键连接而形成多聚糖，CS在美国大量用于骨关保护类膳食补充剂［4-5］。

硫酸角质素（Keratan Sulfate，KS）是硫酸软骨素的共生物，也是属于糖胺聚糖的一种，以半乳糖与6-硫酸-N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1，4糖苷键组成二糖单位，二糖之间通过β-1，3糖苷键连接形成线性分子，是鲨鱼软骨多糖成分中不含糖醛酸的糖胺聚糖［1］。KS是商品硫酸软骨素中的一种共纯化杂质，与蛋白质等在药典中有限量要求的杂质不同的是，KS是主要的非限制性杂质［6］。本文拟探索简单有效的分离鲨鱼软骨多糖中的硫酸角质素组分的方法。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

鲨鱼软骨：烟台大宸食品有限公司；鲨鱼硫酸软骨素标准品、硫酸角质素标准品、硫酸软骨素ABC酶、硫酸角质素酶、糖醛酸：购于sigma公司；硫酸、咔唑等其它试剂：购于上海试剂一厂，均为分析纯。Mono Q 5/50GL、Agilent-SAX强阴离子交换色谱柱：购于GE公司。

Agilent1260 Infinity液相色谱仪、岛津UV2550紫外分光光度计、梅特勒S20 pH计。

1.2方法

1.2.1鲨鱼软骨多糖混合物的提取方法

取1 kg鲜新鲨鱼头部软骨，匀浆后加入6.0 L纯化水，调节pH 7.5～8.0，加入8.0 g（相当于软骨质量的0.8％）木瓜蛋白酶于50℃水解8 h。调节pH 6.0，85℃处理10min。将水解液离心去除不溶物后再用微孔滤膜过滤澄清。选用截留分子量10 kDa的超滤膜将料液浓缩到1/6体积。浓缩后的料液中加入4倍体积无水乙醇，离心得到鲨鱼软骨多糖混合物沉淀，烘干。

1.2.2鲨鱼软骨多糖中硫酸角质素的分离

将鲨鱼软骨多糖混合物用纯化水溶解为含量8％的溶液，分别加入氯化钠（浓度范围为1％～2％）和乙醇（终浓度50％～60％）。于4℃静置8 h后所得多糖沉淀用无水乙醇脱水烘干。

1.2.3Mono QHPLC［7］测定硫酸角质素含量

液相柱：Mono Q 5/50GL；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样量：50μL；检测波长：215 nm；洗脱：A、10 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl洗至基线平衡；B、0～5min 0.5mol/LNaCl-10mmol/L pH 7.4 Tris-HCl；C、5min～ 65 min 0.5mol/L～3mol/LNaCl-10mmol/L pH7.4 Tris-HCl线性洗脱。

1.2.4糖醛酸含量测定

采用modifed carbazolemethod［8］。以葡萄糖醛酸作为标准品，为了消除中性糖的干扰，先测定中性糖的吸收度后，从样品的吸收度值中减去中性糖的吸收度值，即为糖醛酸的吸收度值。

1.2.5硫酸软骨素含量测定

酶解液相法［6］，样品经硫酸软骨素ABC酶充分消化后，用SAX色谱柱分离二糖组分，对二糖组分峰面积的积分来确定硫酸软骨素钠含量。

2　结果与分析

图1　M ono Q HPLC法检测鲨鱼软骨多糖组分Fig.1 Determ ination of polysaccharose in shark cartilageby M ono Q

2.1Mono QHPLC法检测鲨鱼软骨多糖硫酸角质素

鲨鱼软骨多糖混合物经Mono QHPLC色谱柱分析，结果显示存在峰1和峰2（图1A）。鲨鱼软骨多糖混合物经硫酸软骨素ABC酶处理后，再用Mono Q HPLC分析，结果显示峰1消失，而峰2仍存在（图1B）。硫酸软骨素ABC酶可以降解硫酸软骨素而对硫酸角质素无降解作用，故图1A中的峰1组分可以确认为硫酸软骨素。鲨鱼软骨多糖混合物经硫酸角质素酶处理后，再用Mono QHPLC分析，结果显示峰2消失，而峰1仍存在（图1C）。由于硫酸角质素酶可以降解硫酸角质素而对硫酸软骨素无降解作用，故图1A中的峰2组分可以确认为硫酸角质素，使用面积积分法（内标）计算含量为20.2％。

2.2硫酸角质素的分离

硫酸角质素在乙醇与水的混合溶液中溶解度比硫酸软骨素大，因此在一定浓度乙醇的作用下，可实现选择性地将硫酸软骨素沉淀下来，而硫酸角质素留在乙醇水溶液中，加入适量无机盐有利于分级沉淀［9］。由于硫酸软骨素中含有糖醛酸而硫酸角质素不含有糖醛酸，因此检测糖醛酸的含量结合Mono QHPLC法，即可直观地表示沉淀中硫酸软骨素与硫酸角质素的含量，见表1。

由表1可以看出，KS出现与硫酸软骨素共同沉淀的现象的条件为：氯化钠浓度为2.0％，乙醇浓度大于等于56％时；氯化钠浓度为1.5％，乙醇浓度大于等于57％时；氯化钠浓度为1.0％，乙醇浓度大于等于60％时。而在低于上述乙醇浓度时，硫酸角质素几乎全部留在乙醇水溶液中，而沉淀中几乎全部为硫酸软骨素。

以氯化钠浓度为2.0％，乙醇浓度为52％为例，鲨鱼软骨多糖乙醇分级沉淀后的上清液和沉淀相组分MonoQHPLC分析，见图2。

表1　乙醇分级沉淀后鲨鱼软骨素多糖组分含量测定Table1 Determ ination the contentsof polysaccharides from shark cartilageafter ethanolprecipitation

图2　M ono Q HPLC法检测乙醇沉淀后鲨鱼软骨多糖组分Fig.2 M ono Q determ ination of polysaccharoseof shark cartilagebymeansof sequentialprecipitation w ith ethanol

2.3酶解液相分析

为了进一步确定乙醇分级沉淀分离硫酸角质素的有效性，将样品经酶解高效液相方法分析，结果显示去除硫酸角质素前后鲨鱼软骨多糖中硫酸软骨素二糖组成没有明显的变化，可见去除硫酸角质素未影响硫酸软骨素的结构。氯化钠浓度为2.0％，乙醇浓度为52％时沉淀多糖中硫酸软骨素的含量见表2。

表2　硫酸软骨素含量测定Table2 Determ ination the contentof CS ％

由于硫酸软骨素ABC酶的专一性，不会降解硫酸角质素，所以使用现行药典中的酶解液相方法检测硫酸软骨素含量，可避免KS的干扰。

从酶解液相的结果看，鲨鱼软骨多糖混合物中含有大约20％的非硫酸软骨素成分，这个结果与Mono QHPLC分析方法所测得的硫酸角质素含量20.2％相吻合。去除硫酸角质素后，鲨鱼软骨多糖中硫酸软骨素含量显著提高，接近标准品中硫酸软骨素的含量。

3　结论

利用水溶液中硫酸软骨素和硫酸角质素受乙醇和氯化钠浓度影响的细微差别，使用乙醇分级沉淀的方法快速简便的分离鲨鱼软骨多糖中的硫酸角质素，对其中的硫酸软骨素结构没有产生影响，可得到产品纯度高于99％的鲨鱼硫酸软骨素，同时初步给出Mono Q色谱柱测定多糖中硫酸皮肤素的含量的实验条件，此检测方法有待进一步优化。

［1］田志强.鲨鱼软骨多糖的分离纯化及其抗类风湿性关节炎作用机制研究［D］.济南：山东大学，2006：1-124

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Study on the Seperation of Keratan Sulfate from Polysaccharose of Shark Cartilage

LI Yan-ni1，CAO Hong-guang2，GUO Lin1，XU Wei-na1
（1.School of Enology，Binzhou Medical University，Yantai 264003，Shandong，China；2.YantaiDongcheng BiochemicalsCo.，Ltd.，Yantai 264006，Shandong，China）

The arm of this researchwas toexplorea simple and effectivemethod for the separation and detection ofkeratan sulfate（KS）in shark cartilage.Themethod to seperate KS from polysaccharidewasethanolprecipitation，the uronic acid contentwasmeasured by sulfuric acid-carbazole，the KScontentwasmeasured byMonoQ HPLC.The precipitation condition was：the salt concentration was2.0％，ethanol concentration was lower than 56％；the saltconcentrationwas1.5％，ethanol concentrationwas lower than 58％；the saltconcentrationwas 1.0％，ethanol concentrationwas lower than 60％.The ethanolprecipitationwasa reliable industrialmethod to seperate KS from polysaccharide，Mono QHPLCmethod wasa simple and effectivemethod to detectKS.

polysaccharoseofsharkcartilage；keratansulfate；MonoQ；seperation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.010

山东省高等学校科技计划（J16LC57）

李燕妮（1980—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：海洋产物分离提取。

2016-06-29