碱性蛋白酶酶解青稞蛋白质的动力学研究

刘立品，吴桂玲，李文浩，张伟，邢静亚，张国权

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100）

碱性蛋白酶酶解青稞蛋白质的动力学研究

刘立品，吴桂玲，李文浩，张伟，邢静亚，张国权*

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100）

为深入了解与调控碱性蛋白酶水解青稞蛋白过程，准确控制其水解程度，获得定向肽组成的酶解产物。采用碱性蛋白酶在温度55℃、pH10.0条件下酶解青稞蛋白，分析酶浓度、底物浓度对青稞蛋白水解度的影响，并建立可控酶解动力学方程。结果表明：青稞蛋白水解度随着初始底物浓度S0的上升而下降，随着初始蛋白酶浓度E0的增加而上升，水解速率随着水解时间的延长而下降。模型的验证结果显示，预测值与实测值基本吻合，通过对E0/S0、反应时间的调节可有效控制水解程度，为利用酶解制备青稞活性肽的产业化实践提供指导。

青稞蛋白；碱性蛋白酶；动力学；水解度

青稞（Hordeum Vulgare L.var.nudum Hook.f）是青藏高原的独有物种和最具高原特色的农作物。其蛋白质含量为6.35％～23.40％，平均值为12.43％，低于燕麦和小麦，但高于其他谷类作物［1］。同时青稞中含有18种氨基酸，人体必需的氨基酸齐全［2-3］，对于补充机体每日必需氨基酸的需要有重要意义。因此青稞作为一种优质的蛋白质来源开始受到越来越多的关注。

酶解是提高食物蛋白质营养价值、改善各种功能特性和扩大蛋白质应用领域的一种有效手段。酶解后的蛋白质具有良好的溶解性、乳化性、贮藏稳定性及风味特性等，同时还可获取具有生物活性的肽，能广泛应用于食品、医药保健品、饲料产品等行业［4］。然而过度酶解会造成蛋白质某些功能特性减弱甚至完全丧失［5］。所以控制蛋白酶解程度对于获得理想的目标产物至关重要。近年来，国内外关于蛋白质酶解的动力学的研究，主要集中在以小麦蛋白［6］、大米蛋白［7-8］为主的植物蛋白以及以乳蛋白［9］和鱼蛋白［10-11］为主的动物蛋白。但少见青稞蛋白质的酶解动力学的报道。因此，本文以青稞中提取的青稞蛋白为原料，研究了碱性蛋白酶水解青稞蛋白质的动力学机制，并建立其水解过程的动力学模型，以期为青稞蛋白质的深度开发利用提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

北青6号（青海地区主要青稞品种）青稞籽粒由西藏农牧科学院研究所提供；碱性蛋白酶（酶活力＞10 000 U/g，实测酶活105U/g）：英国BDH公司；福林酚：美国sigma试剂公司；盐酸、氢氧化钠、甲醛等化学试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

TDL-5-A台式离心机：上海安亭科学仪器厂；PB-10 pH计：赛多利斯科学仪器有限公司；UV-1700紫外分光光度计：日本岛津公司；KJELTE2100半自动凯氏定氮仪：瑞典富斯-特卡脱公司；79-1型磁力加热搅拌器：江苏荣华仪器制造有限公司。

1.3试验方法

1.3.1青稞蛋白的提取及酶解

以青稞全粉为原料，采用碱溶酸沉法［12］提取。

取适量青稞蛋白，按一定底物浓度加水配成悬浮液，加1mol/L氢氧化钠溶液将体系pH值调至10.0，加入适量碱性蛋白酶，55℃恒温水解，达到酶解时间后，沸水浴灭酶5min，待冷却至室温后，4 000 r/min离心10min，取上清液放入冰箱冷藏备用。

1.3.2蛋白质含量的测定

粗蛋白含量测定：参照GB/T 5511-2008《谷物和豆类氮含量测定和粗蛋白质含量计算凯氏法》，凯氏定氮法。

1.3.3碱性蛋白酶酶活力的测定

采用Folin-酚法，参照SB/T 10317-1999《蛋白酶活力测定法》和白正晨等［13］的方法。

1.3.4酶解动力学模型的推导

碱性蛋白酶为一种丝氨酸型的内切蛋白酶，水解过程中可生成多种产物，符合双底物顺序反应机理［14-15］。其反应式可表示为：

其中k1、k-1、k2分别为酶与底物的结合常数、解离常数和产物生成常数。

根据李湘等［16］、林伟锋等［17］的数学推导，蛋白酶有限水解蛋白质的动力学模型可用下式表示：

蛋白质酶解过程中水解速率的动力学模型：V=aS0exp［-b（DH）］，exp是指以e为底的指数函数（1）

蛋白质酶解过程中水解度的动力学模型：

式中：DH为水解度，％；V0为空白试验加入甲醛后消耗的氢氧化钠标准溶液体积，mL；V1为测定样品加入甲醛后消耗的氢氧化钠标准溶液体积，mL；V2为水解液总体积，mL；V3为滴定用水解液的体积，mL；c为氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；m为水解液中氨基氮的总量（凯氏定氮法），g。

1.3.6数据分析

采用软件origin8.5对水解度与水解时间的方程式（2）进行非线性拟合；模型预测值与实测值之间的拟合程度通过平均相对误差（E）进行评估。

式中：V表示反应速率，g/（L·min）；DH为水解度，％；E0为初始蛋白酶浓度，g/L；S0为初始底物浓度，g/L；c0为与底物浓度有关的碱性蛋白酶被钝化的量的大小；k2为反应速率常数，min-1；km为米氏常数，min-1，代表酶促反应中底物与酶之间结合力的强弱，km值大则其结合力弱，km值小则底物与酶之间亲和力强［18］。

从动力学模型可知，若a≤0（即E0/S0≤c0），则V≤0，此时蛋白质水解无法实现。因此蛋白酶催化水解蛋白质，在初始底物浓度S0固定时，其初始蛋白酶浓度存在一个最低的临界酶浓度，即初始蛋白酶浓度应满足E0＞c0S0；同理，当初始蛋白酶浓度E0处于一定值时，初始底物浓度也存在一个最大的阈值，即初始底物浓度应满足S0＜E0/c0。

由方程（3）可知，a的大小与酶解体系初始底物浓度S0和初始蛋白酶浓度E0有关，随着S0的上升而减小，随着E0的上升而增大；由于k2与水解温度有关，因此，a的大小也随着水解温度的变化而变化。b的大小则与S0和E0无关，但与水解温度的高低有关。因此在恒温水解反应中，b的大小应为一个常数；a的大小只与酶解体系初始底物浓度和初始蛋白酶浓度有关。

1.3.5水解度的测定

采用甲醛滴定法［19］。水解度按下式进行计算：

2　结果分析

2.1酶解动力学参数的确定

为了确定动力学模型中的各个参数，研究水解体系中初始底物浓度S0和初始蛋白酶浓度E0对水解度的影响。在pH 10.0、反应温度55℃条件下，以青稞蛋白为底物，碱性蛋白酶为催化剂进行水解。初始酶浓度为1.2 g/L时，不同底物浓度（5、10、20、30、40 g/L）对水解度的影响见图1。初始底物浓度为10 g/L时，不同酶浓度（0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g/L）对水解度的影响见图2。

图1　初始底物浓度S0对水解度的影响Fig.1 Effectsof the initialsubstrate concentration on the degreeof hyd rolysis

图2　初始酶浓度E0对水解度的影响Fig.2 Effectsof the initialenzyme concentration on thedegreeof hydrolysis

由图1、图2中可知，在一定初始底物浓度和蛋白酶浓度下，蛋白质水解度随酶解时间的增加而升高，在同一处理时间下，水解度随初始底物浓度的增加而下降，随初始蛋白酶浓度的增加而上升。这表明底物对酶的活力可能存在抑制作用［11］；而酶用量的增加可以大大增加酶与底物结合的几率，从而增加水解度。对于同一初始底物浓度，水解速率随着水解时间的延长而下降，并趋向于一个极限值，极限值随初始底物浓度的增大而呈下降趋势。由此推测在反应体系中，底物可能对酶有抑制作用，当底物浓度达到一较大值后，这种抑制作用增强。另外，过高的底物浓度易造成水解液黏度增大，影响蛋白酶扩散，从而对水解反应产生抑制作用［20］。对于同一初始酶浓度，水解速率随着水解时间的延长而下降，并趋向于一个极限值，极限值随初始酶浓度的增加而提高。即体系水解速率随反应时间和水解度的增加而减小，这可能归因于：1）随着酶解反应的进行，水解体系中可作用肽键的浓度下降；2）产物中的某些组分可能与酶的活性部分结合，对酶产生抑制作用，导致体系整体反应速率较之反应初始阶段有明显的下降趋势；3）随着底物浓度的增加，体系中有效底物与酶结合时阻碍作用增大［16］。

利用软件origin8.5对水解度与水解时间的方程式进行非线性拟合，求得动力学参数a和b，结果如表1所示。

表1　青稞蛋白质酶解动力学参数Table1 Valuesof kinetic param eters for hyd rolysisof hulless barley protein

由表1可知，动力学参数a随着初始底物浓度S0的增加而减小，随着初始蛋白酶浓度E0的增大而增大。动力学参数b在不同的初始底物浓度和初始蛋白酶浓度条件下，其数值都相差很小，接近一个常数。因此在一个恒温水解反应中，b可以看作是一个常数，取其平均值0.490，这与模型推导所得结论一致。

2.2酶解反应速率常数的确定

由方程（3）可知，参数a依赖于酶解反应速率常数k2，对a值与E0/S0值作图，确定k2，并验证方程的拟合情况，如图3所示。

图3　参数a值与初始酶浓度/初始底物浓度的线性关系Fig.3 Linear relationship between parameter a and thevaluesof initialenzym e concentration/initialsubstrate concentration

由图3得到的线性关系式可知，a值随着E0/S0值关系曲线所对应的方程为

酶解反应速率常数k2=8.935 8min-1；c0=2.34×10-3。由此可知，在温度55℃、pH10.0条件下，不同初始底物浓度所对应的临界初始蛋白酶浓度为E0=2.34× 10-3S0，不同初始酶浓度所对应的临界初始底物浓度为S0=427.55E0。即当E0≤2.34×10-3S0或S0≥427.55E0时，水解速率为负数，水解反应不会发生。因此，碱性蛋白酶可控酶解青稞蛋白的水解反应需满足：E0＞2.34×10-3S0；S0＜427.55E0。

将a值和b值代入方程V=aS0exp［-b（DH）］中，可得到碱性蛋白酶酶解青稞蛋白的动力学模型分别为：

水解速率的动力学模型：V=（8.935 8E0-0.020 9S0）exp（-0.49DH）

水解度的动力学模型：DH=2.041ln［1+（4.38E0/S0-0.010 2）t］

从动力学模型可知，水解速率随着初始蛋白酶浓度的增加而上升，但随着水解度的上升而下降，这与图1和图2中的试验结果相符。由图3可知，a值与E0/S0值有良好的线性关系，与由反应机理推导所得的公式一致，再次证明动力学模型的有效性。

2.3蛋白酶失活速率常数的确定

将a与b相乘得到关系式：

式中：k4为水解反应过程中碱性蛋白酶的失活常数。参数ab值与k4呈线性关系，对ab值与E0/S0值作图得到的线性关系式为：

青稞蛋白水解过程中碱性蛋白酶的失活常数为k4=3.564 7min-1，失活常数越小，底物及产物抑制作用越强［21］。为提高蛋白酶的酶解效率，可通过分析碱性蛋白酶酶解产物组成，分离出抑制性强的产物来实现。

图4　参数ab值与初始酶浓度/初始底物浓度的线性关系Fig.4 Linear relationship between parameter ab and thevaluesof initialenzyme concentration/initialsubstrate concentration

2.4动力学模型验证

把可控酶解的动力学模型的计算结果与实际水解结果进行对比，可以验证动力学模型的实际应用价值。图中选择初始底物浓度10 g/L、初始酶浓度分别为0.6、0.8 g/L条件下获得的水解度与酶解动力学模型计算得到的水解度进行作图比较，结果见图5。

图5　水解动力学模型的验证Fig.5 Validation on kinetic hydrolysismodel

如图5所示，动力学模型的计算值与实测值在酶解初始阶段相当吻合，但随着反应的进行，其计算值与实测值有一定的差异。这可能是由不同肽链长度的酶解产物对反应速率的抑制作用大小存在差异引起的。采用平均相对误差对实测值与模型预测值之间的拟合程度进行评估，结果表明，当初始底物浓度为10 g/L、初始酶浓度为0.6 g/L时，实测值与预测值之间的平均相对误差为4.31％；初始底物浓度为10 g/L、初始酶浓度为0.8 g/L时，实测值与预测值之间的平均相对误差为3.62％。两体系所考查数据的总平均相对误差为3.97％，动力学模型预测结果与实验结果相当吻合，这说明所建立的动力学模型具有很高的实际应用价值。

3　结论

采用碱性蛋白酶在温度55℃、pH10.0条件下对青稞蛋白进行水解，水解度随着初始底物浓度S0的上升而下降，随着初始酶浓度E0的增加而上升。水解速率动力学模型为：V=（8.935 8E0-0.0209S0）exp（-0.49DH）；水解度的动力学模型为：DH=2.041ln［1+（4.38E0/S0-0.010 2）t］。

碱性蛋白酶水解青稞蛋白过程中，不同初始底物浓度所对应的初始蛋白酶浓度应满足：E0＞2.34×10-3S0；不同初始酶浓度所对应的初始底物浓度应满足：S0＜427.55E0；可控酶解过程中碱性蛋白酶的失活常数k4= 3.371 3min-1，水解动力学模型的预测值与实验值相比较，总平均相对误差为3.97％，预测值与实测值非常吻合，可用来指导和优化酶解反应。

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Kinetic Studies on Hulless Barley Protein Hydrolysis by Alkaline Protease

LIU Li-pin，WUGui-ling，LI Wen-hao，ZHANG Wei，XING Jing-ya，ZHANG Guo-quan*
（College of Food Scienceand Engineering，North west A＆amp;FUniversity，Yangling 712100，Shaanxi，China）

In order to understand and control the hydrolysis process of alkaline protease on hulless barley protein，and obtain the targetpeptides from enzymolysis productsby controlling the degree ofhydrolysis accurately，effects of enzyme concentration and substrate concentration on the degree of hydrolysis of hulless barley proteinwere studied，and the kineticsequation of limited hydrolysiswasalso established through the enzymatic hydrolysisofhullessbarley protein by alkaline protease at55℃and pH10.0.The results showed thathydrolysis degreeofhullessbarley proteinwas increasedwith the initialenzyme concentration（E0）increasing，while decreased alongwith the initial substrate S0concentration increasing.Hydrolysis rate was decreased with the extension ofhydrolysis time.The verification of themodelshowed thatpredicted valuesagreedwellwith theexperimentaldata.Therefore，hydrolysisdegree can beeffectively controlled through theadjustmentof E0/S0ratio and reaction time.These results could be used as the guidance to industrial production ofhullessbarley active peptidesbymeansofenzymatic technology.

hullessbarleyprotein；alkalineprotease；kinetic；degreeofhydrolysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.005

西藏农牧科院农业研究所委托项目（CARS-05-05B）

刘立品（1989—），女（汉），硕士研究生，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程。

张国权（1968—），男（汉），教授，博士，研究方向：谷物品质评价及淀粉工程技术。

2015-12-23