苹果梨中多酚氧化酶的性质及多酚成分定性

权伍荣，康优，沈明浩

（1.延边大学农学院，吉林龙井133400；2.长春市食品药品监督管理局，吉林长春130051；3.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）

苹果梨中多酚氧化酶的性质及多酚成分定性

权伍荣1，康优2，沈明浩3，*

（1.延边大学农学院，吉林龙井133400；2.长春市食品药品监督管理局，吉林长春130051；3.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）

以苹果梨中的多酚氧化酶（PPO）为研究对象，对其酶的性质及多酚成分进行研究。采用分光光度法测定酶活，利用高效液相色谱法定性苹果梨果肉中的酚类物质。PPO在pH值为7.8时酶活波峰最大，在7.4时酶活下降趋势最不明显；当底物浓度大于3mmol/L时，随着浓度的增加，PPO活性反而下降，底物为表儿茶酚时酶活最强；苹果梨果肉中可检测到的酚类物质包括儿茶酚、绿原酸、表儿茶素和槲皮素。结果表明：PPO的最适pH值为7.8，PPO在pH为7.4时最稳定；表儿茶酚和PPO的亲和力最高；苹果梨中的酚类物质绿原酸含量最多，其次含量较高的是儿茶素和槲皮素。

苹果梨；多酚氧化酶；高效液相；定性；含量

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，简称PPO）在植物界乃至动物界分布广泛，由于其检验方便，使被最早研究的几类酶之一［1］。

苹果梨（PyrusPyrifolia Nakai）是吉林延边自治州特产，品质上等，极耐贮藏，但加工时极易褐变，影响了商品价值和经济价值。而梨中的多酚氧化酶是引起褐变的主要因素之一［2］。多酚氧化酶能催化各种酚类物质氧化成为醌，醌类化合物是具有高反应性的物质，可以参与许多不同的反应途径，它们是强亲电试剂，在果蔬衰老和贮藏过程中可以被其它酚类化合物、氨基酸、蛋白质亲核攻击而产生深褐色或者黑色的色素，并随时间的延长而逐渐变黑［3-5］。

所以以苹果梨为原材料，必须掌握多酚氧化酶的酶学特性，不然用苹果梨做出的成品，从口味上，从感官上，都很难满足消费者的要求，而且不能把握好制成品的各种指标。针对这些问题，本文旨在研究多酚氧化酶的酶学特性及其定性，为进一步阐明苹果梨褐变机制以及开发苹果梨贮藏及加工过程中的护色保鲜技术提供一定的理论参考。

1　材料与方法

1.1材料

无损伤、品质良好的延边苹果梨。

1.2试剂

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、Tris、盐酸、硼砂、氢氧化钠：北京化工厂；甲醇、乙腈、PVPP（聚乙烯吡烷酮）、表儿茶酚、儿茶酚、绿原酸、咖啡酸、没食子酸、无水亚硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵、硫酸钾、硝酸铝：北京鼎国生物技术有限公司；以上均为色谱纯。

1.3仪器

AnkeGL-20G-II离心机：上海沪粤明科学仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）真空泵抽滤装置：上海博尔康电子有限公司；TU-1810北京普析通用紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；JB-3A磁力搅拌机：上海理达仪器厂；LGJ-12冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司。

1.4方法

1.4.1PPO的提取

匀浆后丙酮抽提法［6］：称取果肉60 g，采用匀浆法中提取酶液的方法提取酶液，并加入1.6倍体积的冷丙酮，离心10min，取沉淀，用浓度为0.2mmol/L的缓冲液再溶解，再离心10min，取上清液，用滤膜过滤，用聚乙二醇浓缩至20mL，冷冻干燥成粉，备用。

1.4.2溶液的配制

1.4.2.1缓冲液的配制

配制磷酸氢二钠和柠檬酸缓冲液（pH3.0～7.4），Tris-盐酸缓冲液（pH8.2～8.9），硼砂-氢氧化钠缓冲液（pH9.3～9.8），磷酸一氢钠和磷酸氢二钠缓冲液（pH7.3 20mmol/L）备用［7］。

1.4.2.2酶液的配制

酶液1：将0.2 g已干燥的酶粉用100mL、pH7.3、20mmol/L磷酸盐缓冲液溶解，滤膜过滤后备用。

酶液2：将0.01 g酶粉用5mL不同pH的缓冲液溶解，滤膜过滤后备用。

1.4.2.3底物的配制

取一定量的没食子酸、表儿茶酚、儿茶酚、绿原酸、咖啡酸，分别溶于100mL、pH7.3、20mmol/L磷酸缓冲液中，稀释成0.005mol/L，备用。

1.4.2.4不同金属离子缓冲液的配制

取一定量的无水亚硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硝酸镁，分别溶于100mL、pH7.3、20mmol/L磷酸缓冲液中，浓度为0.1mol/L［8］。

1.4.3苹果梨中多酚氧化酶的性质测定

1.4.3.1PPO最适pH值的测定

比色皿中整个体系为3mL，体系中加入2.4mL不同pH值的缓冲液，0.2mL儿茶酚，0.4mL已配制的酶液1，混匀。利用紫外分光光度计在420 nm的波长下测定其活力。计时1min，记录开始和结束时的吸光度值。在测定条件下，吸光度每变化0.001个单位定义为一个酶活［9］。

1.4.3.2PPO在不同pH值缓冲液中稳定性的测定

取酶液2，测其在不同pH值缓冲液中的活力。

1.4.3.3PPO在不同底物浓度中的测定

取酶液1，测其在不同底物不同浓度下的活力。

1.4.3.4PPO在不同金属离子中的测定

取酶液1，测其在不同金属离子缓冲液中的活力［10］。

1.4.3.5苹果梨中酚类物质的定性研究

样品处理：取苹果梨果肉50 g，加入150mL无水乙醇匀浆，匀浆后用超声波细胞粉碎机超声粉碎30 min，4℃下3 000 r/min冷冻离心，去沉淀留上清。将所得上清液旋转蒸发至20mL，0.45μm滤膜过滤后放入4℃保存，待测［11］。

苹果梨中多酚类物质的测定：采用液相色谱法，色谱条件为：A液为甲醇，B相为含1％冰醋酸的超纯水，柱温30℃，流速0.4mL/min，检测波长为280 nm，进样量为5μL［12］。

2　结果与讨论

2.1PPO最适pH值的确定

pH值对PPO活力的影响见图1。

图1　pH值对PPO活力的影响Fig.1 Effectsof pH on activity of PPO

从图1中可以看出，苹果梨的酶活在pH=5.0和pH=7.8时都出现了较大的波峰，但在7.8时酶活力最大。苹果梨中PPO的最适pH值为7.8，当pH值低于5.0或高于7.8时，PPO的活性下降而且下降很快，但pH5.0～6.6其活性变化较不稳定，当pH＜4.2和pH＞9.3，PPO的活性几乎为0。这主要是因为苹果梨PPO是一种含铜的蛋白质，其作用机制在于氧化还原作用［13］。当pH值较低时，一方面，酶中的铜被解离出来，使酶失活；另一方面，酸性较低，蛋白质变性也使酶失活，碱性环境下铜与酶蛋白脱离，生成不溶性Cu（OH）2，也会使酶失活［14-15］。因此加工过程中调整pH值可减少褐变的发生。

2.2PPO在不同pH值缓冲液中的稳定性

pH值对PPO稳定性的影响见图2。

图2　pH值对PPO稳定性的影响Fig.2 Impactof pH valueon thestability of PPO

从图2中可以看出，PPO在pH=7.4时活力最高，下降趋势最不明显，在pH5.8～7.8，PPO活力随时间的延长变化不大，但pH＜5.8或pH＞7.8时，时间越长，PPO活力越低。说明PPO在pH=7.4的环境中最稳定性，在pH5.8～7.8的环境中也很稳定，在pH＜5.8和pH＞7.8的环境中不稳定。PPO浸泡在不适当的外环境中时间越长，活力越低。并且可以看出PPO的活力在过酸或过碱条件下都得到有效抑制，而且时间越长对其抑制能力越强。

2.3不同底物浓度对PPO活力的影响

不同底物浓度对PPO的影响见图3，浓度为0.3 mmol/L的不同底物对PPO活力的影响见图4。

图3　不同底物浓度对PPO的影响Fig.3 Influenceof different substrate concentration on the PPO

图4　浓度为0.3mm ol/L的不同底物对PPO活力的影响Fig.4 Influenceof different substrateson PPO activity when the concentration was0.3mmol/L

从图3中可以看出，在较低浓度范围内，随着底物浓度的增加，PPO的活力增加，当表儿茶酚、绿原酸、儿茶酚浓度达到3mmol/L时，PPO的活力达到最大值，高于该浓度时，活力反而下降。咖啡酸和没食子酸在0.3mmol/L～4mmol/L时酶活力始终不变，并且接近于0。从图4中可以看出，在相同浓度相同条件下，表儿茶酚的酶活力最高。当底物浓度在低范围内，随着浓度的增加，PPO保持较高活性；底物浓度继续增加，PPO活性达到一个极限后呈现下降趋势，这是高浓度底物PPO活性起了抑制作用的结果，可能由于反应产物的积累会抑制酶活［16］。底物浓度在极低范围内，底物浓度增加，不影响酶的活性，只有当底物浓度达到一定值时，才会发生相应的变化。在所用的各种底物中亲和力的顺序如下：表儿茶酚＞儿茶酚＞绿原酸＞咖啡酸＞没食子酸。表儿茶酚对PPO的亲和力最强，它在极低浓度时就能使PPO显示较高活性。没食子酸在低浓度下几乎无PPO活性产生。

2.4PPO在不同金属离子中的酶活

Mg2+、Na+、Al3+和K+等金属离子对PPO的活性有抑制作用［17-18］，见图5。

图5　金属离子对PPO的影响Fig.5 Effectsofmetal ion on PPO

从图5中可以看出，在钠离子中，PPO的活力最高；而在铝离子中PPO的活力最低；在镁离子和钾离子中，PPO的活力相差不大。苹果梨中的PPO在不同的金属离子溶液中，其活性也各不相同。其活性大小：Na+＞Mg2+＞K+＞Al3+。在钠离子的溶液中，PPO表现出较大的活性，在铝离子中，PPO的活性受到较大抑制。以钠离子中的吸光值为对照，其它离子中的吸光值所占钠离子的比值为：（所测离子中的吸光值/钠离子中的吸光值）×100％。

2.5苹果梨中酚类物质的定性研究

根据HPCL法，对标准液和样品进行测定得到图6和图7。

图6　标准品色谱图Fig.6 Chromatogram of standards

图7　苹果梨果肉中酚类物质色谱图Fig.7 Chrom atogram sof phenolics in the the flesh of apple pears

由图6和图7可知，苹果梨果肉中检测到的酚类物质有儿茶素、绿原酸、表儿茶素和槲皮素等，其中含量最多的是绿原酸，其次含量较高的有儿茶素和槲皮素，其余含量很低。

3　结论

PPO的最适pH值为7.8，PPO在pH为7.4时最稳定，pH5.8～7.8时很稳定，pH＜5.8和pH＞7.8不稳定，且时间越长PPO的活力越低；底物浓度在极低范围内，底物浓度增加，不影响酶的活性，当底物浓度在低范围内，随着浓度的增加，PPO活性增加，当底物浓度大于3mmol/L时，随着浓度的增加，PPO活性反而下降；表儿茶酚和PPO的亲和力最高；苹果梨果肉中可检测到的酚类物质有儿茶素、绿原酸、表儿茶素和槲皮素等，其中含量最多的是绿原酸，其次含量较高的有儿茶素和槲皮素，其余含量很低。

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Characterization of Polyphenol Oxidase and Composition of Polyphenols in Apple Pear

QUAN Wu-rong1，KANG You2，SHEN Ming-hao3，*
（1.Agricultural College，Yanbian University，Longjing 133400，Jilin，China；2.Changchun Food and Drug Administration，Changchun 130051，Jilin，China；3.College of Food Scienceand Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China）

With apple pears of polyphenol oxidase（PPO）as the research object，the characterization of polyphenoloxidaseand composition ofpolyphenolswere studied.Using spectrophotometricmethod to determine the enzyme activity，the qualitative ofphenolic in apple pearswas determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.PPO enzymeactivity reached the topwhen pH was7.8，andwhen pH was7.4 enzymeactivity declined notobviously，when the concentration of substratewasmore than 3mmol/L the activity of PPOwas decreasedwith the concentration ofsubstrate increased，enzyme activity reached the top when the substratewas epicatechin.Catechol，chlorogenic acid，epicatechin andmeletin could be detected in the flesh of apple pear by polyphenolsby high performance liquid chromatography（HPLC）.The resultsshowed that theoptimum pH of PPOwas7.8，when pH was7.4，the stability of PPOwas the strongest，PPO had the bestaffinitywith epicatechol，among the total，the contentsofchlorogenic acidwashighest，the catecholandmeletinwassecond.

applepear；polyphenoloxidase；highperformance liquid；qualitayive；content

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.006

权伍荣（1961—），男（朝鲜），教授，博士，研究方向：食品工程、食品安全。

沈明浩（1963—），男（朝鲜），教授，硕士生导师，研究方向：食品毒理与安全，胚胎毒理。

2015-10-23