零陵宽皮柑橘果皮中黄酮的提取工艺研究

2016-11-15李文艺

湖南科技学院学报 2016年5期

李文艺　张　海

零陵宽皮柑橘果皮中黄酮的提取工艺研究

李文艺张海

（湖南科技学院化学与生物工程学院，湖南永州 425199）

以零陵宽皮柑橘皮为原料，采用水浴浸提和超声波辅助提取两种方法来提取宽皮柑橘果皮中的黄酮，在使用单因素实验方法的基础之上，进一步采用正交实验方法优化提取工艺。其中，水浴浸提法的最佳工艺条件为：温度55 ℃、乙醇浓度60 %、时间2.0 h、料液比1：30 (g/mL), 其黄酮提取率为8.5970 mg/g；超声波辅助提取的最佳工艺条件为:乙醇浓度80 %，超声时间35 min, 料液比1:40 (g/mL)，其黄酮提取率为9.5720 mg/g。通过对两种实验方法进行比较，得出超声波法更加切实可行。

零陵宽皮柑橘；水浴浸提法；超声波提取法；黄酮；工艺研究

零陵地处湖南永州市，气候湿润，光照时间长，非常适合柑橘生长。零陵出产的宽皮柑橘不仅表皮看起来颜色艳丽、非常诱人，而且尝起来皮薄核少、酸甜适当。其果皮非常宽松，因此手撕起来，果皮果肉极易分离，手感很好。

黄酮有很多种功效，比如它有抗氧化性[1]；能够加强血液循环[2]；能够降低胆固醇[3]；有扩张冠状血管活性，调节血管渗透性，降低血糖的作用[4]；也有防癌抗癌的效用[5]。目前黄酮的提取方法一般有：水提法[6]、有机溶剂提取法[7]、超声波辅助提取法[8]、微波提取法[9]、超临界流体提取法[10]等，黄酮的分析方法一般有：紫外分光光度法[11]、高效液相色谱法[12]、毛细管电泳法[13]等。

现今柑橘是世界上产量最高的水果之一，国际贸易金额高达近400亿人民币，成为第三大贸易农产品[14]。随着柑橘产量激增，也产生大量的皮渣。丢弃的橘皮会对环境造成污染，更浪费了一种很好的资源。本研究充分利用零陵地区的宽皮柑橘资源，以其果皮为原料，研究从宽皮柑橘皮中采用超声波辅助提取和有机溶剂提取两种方法提取黄酮的最佳工艺条件，对比两种实验方法，得出最佳工艺条件，为零陵宽皮柑橘果皮的开发利用提供理论和实验基础。

1　材料与方法

1.1 材料与试剂

零陵宽皮柑橘购买于在当地果农处，随后果皮分离，将其放入烘箱中，设定温度为50 ℃，防止高温引起成分变性，持续烘干24小时后，用高速多功能粉碎机将其粉碎，收藏至干燥环境中，以备使用；芦丁标准品，上海强顺化学试剂有限公司；无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SHZ-DIII型循环水真空泵，巩义市予华仪器有限公司；GS623型电子分析天平，新光电子株式会社；WG 71型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；752型紫外分光光度计，上海舜宇恒平仪器有限公司；KQ2200型超声波清洗机，江苏省昆山市淀山湖镇；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，郑州长城科贸有限公司；XY-100型高速多功能粉碎机，浙江省永康市松青五金厂。

1.3 试验方法

1.3.1标准曲线的绘制准确称取芦丁标准品10 mg，用60 %乙醇溶液定容于100 mL容量瓶中并振荡摇匀，静置后即得0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。分别吸取0.1 mg/mL的芦丁标准溶液0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于10 mL容量瓶中，依次编号。首先加入60 %的乙醇溶液至5 mL，再加入0.3 mL的5 %的NaNO2溶液，振荡摇匀，静置6 min；再加入0.3 mL的10 %的Al(NO3)3溶液，摇匀，静置6 min；再加入3 mL的1 mol/L的NaOH溶液，最后用60 %的乙醇溶液定容，振荡摇匀，静置15 min。在波长为510 nm处用紫外分光光度计测定，记录数据。

1.3.2水浴浸提法

1.3.2.1 单因素实验用乙醇溶液为提取剂，采用水浴加热回流的方法进行实验。每次都分别精密称取1 g已经处理好的零陵宽皮柑橘果皮粉末于圆底烧瓶中，依次编号，分别加入一定比例的乙醇溶液，水浴浸提。提取完后，抽滤，收集溶液并定容至50 ml，振荡摇匀，静置后，按标准曲线制备法, 测定其吸光度值。然后依次研究不同乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度对黄酮提取率的影响。

1.3.2.2 正交试验经过单因素试验后，综合结论和因素，将乙醇浓度、提取时间、料液比和提取温度设为4个因素，将黄酮提取率设为因素指标，在各个因素最佳条件影响范围内设计3水平4因素L9(34)的正交试验。其因素水平表见表格1-1。

表格 1-1 正交试验因素水平表

水平A乙醇浓度（%）B料液比（g/mL）C提取时间（min）D浸提温度（℃） 1501:201.055 2601:301.560 3701:402.065

1.3.3超声波辅助提取法

1.3.3.1 单因素实验用乙醇溶液为提取剂，采用超声波辅助提取的方法进行实验。每次都分别精密称取1 g已经处理好的零陵宽皮柑橘果皮粉末于圆底烧瓶中，依次编号，分别加入一定比例的乙醇溶液，超声波水浴下提取。提取完后，抽滤，收集溶液并定容至50 ml，振荡摇匀，静置后，按标准曲线制备法，测定其吸光度值。然后依次研究不同乙醇浓度、料液比和提取时间对黄酮提取率的影响。

1.3.3.2正交试验经过以上单因素试验后，综合结论和因素，将乙醇浓度、提取时间和料液比设为3个因素，将黄酮提取率设为因素指标，在各个因素最佳条件影响范围内设计3水平3因素L9(33)的正交试验。其因素水平表见表格1-2。

表格1-2 正交试验因素水平表

水平A乙醇浓度（%）B料液比（g/mL）C提取时间（min） 1701：3525 2801：4030 3901：4535

2　结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的绘制

根据之前的实验，对其结果进行处理作图，用芦丁的质量浓度作为标准曲线的横坐标 (X)，用所对应实验测得的吸光度（A）作为标准曲线的纵坐标 (Y)。如图2-1所示，两者呈线性关系，其方程为:Y=10.185x+0.0115，R2=0.9991。

图2-1 芦丁标准曲线

2.2 样品中黄酮类物质含量的测定

取一定体积的提取液，按照上述方法测定吸光度，对照标准曲线，计算出样品中黄酮含量，按下列计算公式[15]计算：黄酮提取率=（C×V×D）/M 单位：(mg/g)。

式中，C为按照线性回归方程而计算得到的黄酮浓度（mg/mL），V为待测液体积（mL），D为样品稀释倍数，M为柑橘皮粉末重量（g）。

2.3水浴浸提法提取零陵宽皮柑橘果皮中黄酮的结果分析

2.3.1单因素试验结果

2.3.1.1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响分析。由图 2-2可知，黄酮提取率随着乙醇浓度的加大逐渐上升，当浓度为60%时，提取率最大，其值为7.5158mg/g。随后，提取率随着乙醇浓度的增大反而下降。可能是随着乙醇浓度的增大，粉末中更多的杂质随之溶出，使得黄酮提取率有所下降。所以，乙醇浓度以60%为宜。

图2-2乙醇浓度对黄酮提取率的影响

2.3.1.2 料液比对黄酮提取率的影响分析。由图 2-3可知，随着提取液体积的增加，黄酮提取率呈现出先增大后平稳的趋势。先是随着乙醇浓度的增大，黄酮在溶液中快速溶出，当料液比为1:30 (g/mL)的时候，黄酮基本扩散完全，图中1:30-1:50 (g/mL)之间增长趋势很平缓，即使料液比再增大，黄酮提取率增长也不明显，又考虑到溶液容量过多会给后续操作带来不便，因此，料液比以1:30 (g/mL)为宜。

图2-3 料液比对黄酮提取率的影响

2.3.1.3 提取温度对黄酮提取率的影响分析。由图2-4可知，黄酮的提取率随着温度的升高而上升，当温度达到60 ℃时，黄酮的提取率为最大，其值是7.5435 mg/g。随后，黄酮的提取率随着温度的升高而下降。其原因应该是温度的过高导致己溶出的黄酮发生氧化，受到破坏，从而使黄酮提取率下降。因此，提取温度以60 ℃为宜。

图2-4 提取温度对黄酮提取率的影响

2.3.2正交试验结果通过表格2-6的极差值R可以看出，各因素对提取率的影响顺序为：乙醇浓度>料液比>提取温度>浸提时间。乙醇浓度和料液比均对黄酮提取率影响较大，而提取时间和温度对提取率的影响较小。分析可得水浴提取黄酮的最佳工艺条件为：A2B2C 3Dl，即乙醇浓度为60 %、料液比为1:30 (g/mL)、提取时间为2 h、提取温度为55 ℃。

2.3.2验证试验在最佳条件下进行3次平行验证实验，其黄酮的提取率分别为: 8.7121 mg/g、8.6435 mg/g、8.7882 mg/g，平均值为8.7146 mg/g，表明该工艺条件稳定，切实可行。

表2-6 正交试验表格

实验号水平黄酮提取率 ABCD 乙醇浓度(%)料液比（mL/g)提取时间(h)提取温度（℃）（mg/g） 111117.8577 212226.7690 313336.0948 421238.0635 522318.5970 623127.6540 731326.2956 832135.8211 933215.3041 K120.748522.216821.332821.7588 K224.314521.214120.136620.7186 K317.420819.052920.987419.9794 R6.89373.16391.19621.7794

2.4 超声波提取法提取零陵宽皮柑橘果皮中黄酮的结果分析

2.4.1单因素试验结果

2.4.1.1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响分析由图2-7可知，黄酮提取率随着乙醇浓度的增大呈而增大，当乙醇浓度为80 %时，黄酮提取率最高，其值为8.0357 mg/g，随后降低。这应该是由于高浓度的乙醇使更多的杂质溶出，从而导致黄酮提取率下降。所以，选浓度为80 %的乙醇为宜。

图2-7 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

2.4.1.2 料液比对黄酮提取率的影响分析由图2-8可知，黄酮的提取率随着料液比的增加而增大，在料液比为1:10-1:20（g/mL）范围内，黄酮提取率增长迅速，在料液比为1:20-1:50（g/mL）范围内，黄酮提取率缓慢增大。黄酮在乙醇溶液中先是快速溶出，然后当黄酮基本扩散完全后，图中增长趋势很平缓，料液比再增大，黄酮提取率增长不明显，又由于溶液容量过多会给后续操作带来不便，因此，选取料液比为1:40 (g/mL)为宜。

图2-8 料液比对黄酮提取率的影响

2.4.1.3 提取时间对黄酮提取率的影响分析由图2-9可知，在时间范围内，黄酮提取率出现了先增大后减小再增大的变化趋势。其中10-30 min黄酮提取率增加迅速，两处提取率相差l.7122 mg/g，而40 min-60 min处的黄酮提取率相差0.6732 mg/g。由于长时间提取可能破环黄酮结构和溶出更多杂质，所以为了提高效率，减小误差，故超声时间以30 min为宜。

图2-9 提取时间对黄酮提取率的影响

2.4.2正交试验结果由表格3-10的极差值R可知，影响因素顺序为：乙醇浓度>料液比>超声时间。分析得出超声辅助提取法的最佳提取工艺条件为因素A2B2C3，即乙醇浓度为80 %，料液比为1:40 (g/mL)，超声时间35 min。

表 3-10 正交试验结果

实验号水平黄酮提取率 ABC 乙醇浓度(%)料液比（g/mL)提取时间(h) （mg/g） 11113.8687 21225.8501 31335.2629 42126.5316 52239.5720 62318.0690 73137.4545 83228.5355 93317.7576 K114.981717.854819.6953 K224.172623.957620.9172 K323.747621.089522.2894 R9.19096.10282.5941

2.4.3验证试验在该最佳条件进行3次平行验证实验，其黄酮的提取率分别为：9.5978 mg/g、9.6013 mg/g、9.6247 mg/g，平均值为9.6079 mg/g，表明该工艺条件稳定可行。

3　小结与讨论

宽皮柑橘皮中富含精油、维生素、果胶、类黄酮等物质，是既营养又保健的食品原料。并且我国柑橘种植面积辽阔，资源十分丰富，开发利用宽皮柑橘果皮资源具有广阔的前景。本研究首次以零陵宽皮柑橘地方品种为试验材料，系统研究了零陵宽皮柑橘果皮中黄酮类化合物的提取工艺。

本研究在单因素实验的基础上，通过正交试验设计和方法，确定了水浴浸提法和超声波辅助提取法对零陵宽皮柑橘果皮中黄酮的提取的最佳工艺条件。水浴浸提法的最佳工艺条件为：乙醇浓度60 %，浸提时间2.0 h，浸提温度为55 ℃，料液比1:30 g/mL，黄酮提取率为8.5970 mg/g；超声波辅助提取法的最佳工艺条件为：乙醇浓度80 %，超声时间35 min，料液比1：40 g/mL，黄酮提取率为9.5720 mg/g。

对比两种提取方法，综合黄酮提取率、实验时间的长短、经济条件、实验效率等因素，超声波辅助提取法比水浴浸提法更加切实可行。但本研究由于实验装置的原因，没有考虑超声频率、超声温度等因素，所以外部因素影响条件的确定范围过于窄小。

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