哈萨克族食管鳞癌组织中差异蛋白TAGLN、TAGLN2的表达分析

冯志寅，董娟娟，苗　娜，汪　慧，陈　晓

(新疆医科大学1第一附属医院病理科，乌鲁木齐　830054；2基础医学院，乌鲁木齐　830011)



·民族肿瘤学·

哈萨克族食管鳞癌组织中差异蛋白TAGLN、TAGLN2的表达分析

冯志寅1，董娟娟2，苗娜1，汪慧2，陈晓2

(新疆医科大学1第一附属医院病理科，乌鲁木齐830054；2基础医学院，乌鲁木齐830011)

目的对筛选出的食管鳞癌组织中的差异蛋白平滑肌肌动蛋白22α(Transgelin，TAGLN)及其异构体肌动蛋白结合蛋白2(Transgelin2，TAGLN2)进行验证。方法收集新疆医科大学第一附属医院2014年1月-2015年8月食管鳞状细胞癌患者新鲜癌组织及相应癌旁正常黏膜组织标本共28对；按照民族及淋巴结是否发生转移进行分组，运用Western Blot技术对新鲜食管鳞癌组织中的TAGLN、TAGLN2蛋白表达情况进行半定量分析。结果Western Blot技术半定量分析发现TAGLN、TAGLN2在食管鳞状细胞癌肿瘤组织中的表达高于相应癌旁正常组织(P<0.05)；TAGLN在食管鳞状细胞癌淋巴结转移组中的表达高于淋巴结未转移组(P<0.05)。结论TAGLN、TAGLN2是食管鳞状细胞癌发生、发展过程中的重要变化分子。

食管鳞状细胞癌；淋巴结转移；TAGLN；TAGLN2

食管癌(esophageal carcinoma)是世界上常见的消化系统恶性肿瘤之一，在我国每年大约有24万食管癌新发病例[1]。在新疆，食管癌死亡率为13.05/10万，其中哈萨克族调整死亡率为68.88/10万，严重威胁着人们的健康[2]。本课题组前期选取术前未进行放化疗的新鲜手术切除食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行分析，通过蛋白质数据库比对筛选出多组差异蛋白。发现平滑肌肌动蛋白22α(Transgelin，TAGLN、SM22)及其异构体肌动蛋白结合蛋白2(Transgelin2、TAGLN2)在食管磷癌细胞和正常食管上皮细胞的表达可能存在差异。本研究主要对TAGLN、TAGLN2在食管鳞癌组织中的表达情况进行验证并结合临床病理参数进一步分析，以筛选可能的分子标志物。

1　材料与方法

1.1标本收集收集新疆医科大学第一附属医院2014年1月-2015年8月食管鳞状细胞癌患者新鲜癌组织及相应癌旁正常粘膜组织标本共28对。严格按照纳入及排除标准对食管鳞状细胞癌患者进行术前筛选。在标本离体后，立刻剪去癌组织及远端癌旁正常黏膜组织各1块，使用冰生理盐水冲洗2～3遍之后，将组织块置于冻存管中，迅速置于液氮中冷冻，等待常规石蜡切片病理结果，确认为所需病例后放置于-80℃冰箱中长期保存。

1.2纳入及排除标准纳入标准：按照2010版WHO诊断标准，经病理确诊的食管鳞状细胞癌；临床相关资料完整；相关检查排除多发性癌；在新疆医科大学第一附属医院行食管癌根治术。排除标准：患者曾进行过新辅助治疗；局部复发患者；初次确诊时即有转移的患者；术后病理诊断为非食管鳞状细胞癌；患者未签署知情同意书。

1.3标本分组根据所测样本中的蛋白质浓度，以28对新鲜食管鳞状细胞癌标本的病理诊断结果为依据，按如下条件进行分组：哈萨克族食管鳞状细胞癌未发生淋巴结转移肿瘤组织(Kazak/No lymph node metastasis/Tumor，K-NLNM-T)及相应哈萨克族食管鳞状细胞癌癌旁正常组织(Kazak/No lymph node metastasis/Normal，K-NLNM-N)6对；哈萨克族食管鳞状细胞癌发生淋巴结转移肿瘤组织 (Kazak/Lymph node metastasis/Tumor，K-LNM-T)及相应哈萨克族食管鳞状细胞癌癌旁正常组织(Kazak/Lymph node metastasis/Normal，K-LNM-N) 8对；汉族食管鳞状细胞癌未发生淋巴结转移肿瘤组织(Han/No lymph node metastasis/Tumor，H-NLNM-T)及相应汉族食管鳞状细胞癌癌旁正常组织(Han/ No lymph node metastasis/Normal，H-NLNM-N) 6对；汉族食管鳞状细胞癌发生淋巴结转移肿瘤组织(Han/Lymph node metastasis/Tumor，H-LNM-T)及相应汉族食管鳞状细胞癌癌旁正常组织(Han/Lymph node metastasis/Normal，H-LNM-N)8对。

1.4Western Blot鉴定将0.1 g组织块加800 μL组织蛋白提取液(组织蛋白提取试剂盒；康为世纪)，冰上匀浆；4℃、10 000 r/min离心5 min后取上清，-80℃保存。蛋白定量，保证每孔上样量>50 μg；待测样本与4×蛋白上样缓冲液混匀，100℃，10 min蛋白变性。电泳100 V、1 h，冰上电转100 V、1 h；TBS清洗5 min×3 次；BSA Blocking Buffer，室温封闭2 h；一抗(TAGLN：1∶300，bs-2178R，北京博奥森；TAGLN2：1∶300，bs-2977R，北京博奥森)孵育4℃，过夜。TBST清洗10 min×3 次；二抗(康为世纪山羊抗兔1∶8 000)，室温避光孵育1.5 h。TBST清洗10 min×4 次，TBS清洗印迹膜5 min×1 次。BCIP/NBT法显色(BCIP/NBT显色试剂盒；北京Solarbio公司)待出现蛋白条带后停止显色，自来水清洗印迹膜后，避光晾干，于凝胶成像仪中记录结果。首先孵育内参β-Actin，使用Image J软件测量条带灰度值，以使各上样样品内参所得灰度值趋于一致为基准点，调整各样品上样量；每例样本重复实验3次，使用软件测量灰度值后，取其平均值作为该例组织的蛋白表达灰度。

2　结果

2.1TAGLN的Western blot结果TAGLN在分子量22 ku处显出条带，并将所得灰度按照组别绘制条形图。方差分析发现TAGLN在食管鳞状细胞癌肿瘤组织(T)中的表达高于癌旁正常组织(N)，差异有统计学意义(F=113.140，P<0.001)。在食管鳞状细胞癌淋巴结转移组(LNM)中的表达高于淋巴结未转移组(NLNM)，差异有统计学意义(F=4.696，P=0.035)。虽然其在哈萨克族食管癌肿瘤组织(K)中表达高于汉族食管癌肿瘤组织(H)，但尚不能认为这种差异有统计学意义(F=0.170，P=0.682),见图1、图2。

2.2TAGLN2的Western blot结果TAGLN2在分子量22 ku处显出条带，并将所得灰度按照组别绘制条形图，方差分析发现其在食管鳞状细胞癌肿瘤组织(T)中的表达高于相应癌旁正常组织(N)，差异有统计学意义(F=62.554，P<0.001)。在食管鳞状细胞癌淋巴结转移组(LNM)中的表达高于淋巴结未转移组(NLNM)，但差异无统计学意义(F=3.729，P=0.059)。在哈萨克族食管癌肿瘤组织(K)中表达高于汉族食管癌肿瘤组织(H)，但尚不能认为差异有统计学意义(F=0.038，P=0.846),见图3、图4。

Marker:蛋白分子量marker; 1～8:LNM组蛋白表达; 9～14:NLNM组蛋白表达。

注:与相应的癌旁正常组织(N)相比，*P<0.05；与淋巴结未转移组(NLNM-T)相比,△P<0.05。

3　讨论

TAGLN作为重要的细胞骨架相关蛋白，在细胞分化、黏附及迁移中发挥着重要作用，并且是血管重塑的关键分子，由此成为心血管系统相关疾病研究的热点分子。但后续研究也发现TAGLN是参与细胞生长及外基质降解的信号分子之一，在癌组织中表达紊乱。目前认为TAGLN蛋白异常表达与细胞骨架的结构异常存在明显关系[3]，而细胞骨架改变是肿瘤细胞的表型发生变化的基本过程之一。TAGLN2最早从幼稚骨髓细胞系cDNA文库筛出，是肌动蛋白结合蛋白的一种，同时也是TAGLN(SM22)的同源异构体，也发现其在多种肿瘤中存在异常表达。Rho等[4]在差异蛋白筛选中发现TAGLN、TAGLN2在肺腺癌组织及癌旁正常组织中表达存在差异。但TAGLN、TAGLN2在肿瘤组织中表达异常的分子机制尚不清楚，其在食管鳞癌中的表达情况尚缺乏相关报道，进一步研究TAGLN、TAGLN2在食管鳞癌中的表达及其调控机制，对肿瘤的临床治疗有重要意义。

Marker:蛋白分子量marker; 1～8:LNM组蛋白表达; 9～14:NLNM组蛋白表达。

注:与相应的癌旁正常组织(N)相比，*P<0.05。

国外Nair等[5]分析发现，TAGLN可抑制MMP-9的表达，而MMP-9作为细胞外基质蛋白水解酶可以分解多钟细胞外基质成分，其与肿瘤转移及侵袭力增加存在相关性，间接说明TAGLN可能与肿瘤转移及侵袭力增加相关性；国外Yeo等[6]对结直肠癌组织进行Western Blot与免疫组织化学进行分析，发现TAGLN表达缺失或下调与结直肠癌演进、分化及转移存在相关性，而进一步研究发现TAGLN表达恢复可以对结直肠癌发生发展起到抑制作用。国内Qi等[7]利用比较蛋白质组学分型发现TAGLN在食管鳞癌的表达与其他肿瘤细胞中的表达下调不同，TAGLN在食管鳞癌中表达上调。本研究通过Western Blot技术半定量分析发现TAGLN在食管鳞状细胞癌肿瘤组织中的表达高于相应癌旁正常组织。在食管鳞状细胞癌淋巴结转移组中的表达高于淋巴结未转移组。本研究与Qi等[7]的研究结果相一致，提示TAGLN在食管鳞癌组织中表达升高，但尚不能认为其与食管鳞状细胞癌淋巴结转移及不同民族间表达存在相关性，可考虑在后续的研究中加大样本量，以进一步明确上述结论。TAGLN2已经发现在多种癌组织中表达上调，而在食管鳞癌相关研究中，干扰TAGLN2表达后，食管鳞癌细胞系生长受到抑制[8]，提示TAGLN2在肿瘤的发生、发展过程中起一定作用，但TAGLN2在肿瘤组织中表达异常的分子机制尚不清楚，进一步研究TAGLN2在肿瘤的表达及其调控机制，对肿瘤的临床治疗有重要意义。

本研究证实TAGLN、TAGLN2在食管鳞癌组织中表达高于癌旁正常组织，TAGLN在淋巴结转移组中的表达高于未转移组，提示TAGLN、TAGLN2是食管鳞状细胞癌中的重要变化分子。但这种蛋白变化的可能机制尚不清楚，国外Monika 等[9]认为在肿瘤细胞演进过程中，F-actin相关蛋白的异常表达可能是引起TAGLN在肿瘤组织中表达上调的原因。考虑在后续的研究中扩大样本量，进一步明确TAGLN、TAGLN2与患者临床病理参数的相关性，深入研究其表达紊乱的分子机制，为TAGLN、TAGLN2成为可能的食管癌早期诊断分子标志物奠定理论基础。

[1]Zhang Y,Zhang YL,Chen HM,et al.Expression of Bmi-1 and PAI-1 in esophageal squamous cell carcinoma[J].World J Gastroenterol,2014,20(18):5533-5539.

[2]朱丽娟,陈晓,蒲红伟,等.食管鳞状细胞癌组织中uPA和PAI-1表达与浸润转移及预后的关系研究[J].新疆医科大学学报,2014,37(1)：32-35.

[3]Hellstrand P,Albinsson S.Stretch-dependent growth and differentiation in vascular smooth muscle:role of the actin cytoskeleton[J].Can J Physiol Pharmacol,2005,83(10):869-875.

[4]Rho JH,Roehrl MH,Wang JY.Tissue proteomics reveals differential and compartment-specific expression of the homologs transgelin and transgelin-2 in lung adenocarcinoma and its stroma[J].J Proteome Res,2009,8(12):5610-5618.

[5]Nair RR,Solway J,Boyd DD.Expression cloning identifies transgelin(SM22) as a novel repressor of 92-kDa typeIV collagenase(MMP-9)expression[J].J Biol Chem,2006,281(36):26424-26436.

[6]Yeo M,Park HJ,Kim DK,et al.Loss of SM22 is a characteristic signature of colon carcinogenesis and its restoration suppresses colon tumorigenicity in vivo and in vitro[J].Cancer,2010,116 (11):2581-2589.

[7]Qi Y,Chiu JF,Wang L,et al.Comparative proteomic analysis of esophageal squamous cell carcinoma[J].Proteomics,2005,5(11):2960-2971.

[8]Du YY,Zhao LM,Chen L,et al.The tumor-suppressive function of miR-1 by targeting LASP1 and TAGLN2 in esophageal squamous cell carcinoma[J].J Gastroenterol Hepatol,2016,31(2):384-393.

[9]Monika D,Rudolf N,Pavel B.Transgelins,cytoskeletal proteins implicated in different aspects of cancer development[J].Expert Rev Proteomics,2014,11(2):149-165.

(本文编辑杨晨晨)

Study on expressions of TAGLN and TAGLN2 in esophageal squamous cell carcinoma of Kazak

FENG Zhiyin1,DONG Juanjuan2,MIAO Na1,WANG Hui3,CHEN Xiao3

(1Department of Pathology,the First Affiliated Hospital,Urumqi 830054,China;2School of Pre-clinical Medicine,Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China)

ObjectiveTo analyze the expression of TAGLN and TAGLN2 in esophageal squamous cell carcinoma.Methods28 pairs of fresh tissues of carcinoma and adjacent normal mucosa tissues from patients with esophageal squamous cell carcinoma were collection from the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University during January 2014 to August 2015.The expression of TAGLN and TAGLN2 from 28 pair of tissues were analyzed by Western Blotting technology.ResultsIt was found that the expressions of the TAGLN and TAGLN2 in fresh esophageal squamous cell carcinoma tumor tissue were higher than that in adjacent normal tissues (P<0.05); TAGLN in esophageal squamous cell carcinoma with lymph node metastasis was higher than that in the group without lymph node metastasis (P<0.05).ConclusionTAGLN and TAGLN2 are two important changing proteins in the development of esophageal squamous cell carcinoma.

Esophageal squamous cell carcinoma;lymph node metastasis; TAGLN;TAGLN2

国家自然科学基金(81360303)

冯志寅(1986-)，男，硕士，住院医师，研究方向：食管癌蛋白质组学研究。

陈晓，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：食管癌蛋白质组学研究，E-mail：xjchenxiao@sina.com。

R735.1

A

1009-5551(2016)11-1466-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.11.030

2016-09-04]