快速提取-超高效液相色谱法测定唇膏中11种酞酸酯

周江，季倩祎，余妙琴，杨浩，吴重彬

［义乌市产品（商品）质量监督检验研究院，浙江义乌 322000］

快速提取-超高效液相色谱法测定唇膏中11种酞酸酯

周江，季倩祎，余妙琴，杨浩，吴重彬

［义乌市产品（商品）质量监督检验研究院，浙江义乌 322000］

建立快速提取-超高效液相色谱法测定唇膏中11种酞酸酯的检测方法。将唇膏样品涂覆在定量滤纸上，用甲醇涡旋超声提取，色谱柱采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相为乙腈-水，梯度洗脱，流量为0.5 mL/min，用PDA检测器检测，检测波长225 nm。以3倍空白噪音计，邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）的检出限分别为1，2 mg/kg；邻苯二甲酸二丙酯（DPRP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二戊酯（DPP）、邻苯二甲酸二己酯（DHXP）、邻苯二甲酸丁基苄基酯（BBP）、邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）、邻苯二甲酸二正辛酯（DNOP）的检出限为3 mg/kg；邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）、邻苯二甲酸二异癸酯（DIDP）的检出限为30 mg/kg。方法的加标回收率为86.6%～98.6%，测定结果的相对标准偏差为0.6%～6.0%（n=6）。该方法样品处理简单，提取效率高，分离效果好且灵敏度高，结合色谱图和紫外光谱图，能快速准确测定唇膏中11种酞酸酯。

唇膏；酞酸酯；超高效液相色谱法；定量滤纸

酞酸酯（PAEs，又称邻苯二甲酸酯）是邻苯二甲酸及酐与醇类酯化反应生成的化合物。邻苯二甲酸酯类已被世界卫生组织（WTO）公告为环境荷尔蒙物质，具有雌性荷尔蒙的作用，在体内会干扰人体的内分泌系统，特别是生殖系统［1］。酞酸酯在化妆品中主要用作溶剂、塑化剂、香精香料的定香剂。我国的《化妆品卫生规范》2007版［2］和欧盟化妆品法规（EC）NO1223/2009［3］中将邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）等7种PAEs列为化妆品中的禁用组分。

化妆品中的酞酸酯检测方法主要有气相色谱法［4-5］、气相色谱法-质谱法［6-7］、液相色谱法［8-14］、液相色谱-质谱法［15］，但针对化妆品中邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）、邻苯二甲酸二异癸酯（DIDP）测定的方法研究相对较少，用超高效液相色谱法进行测定就更少，目前文献中涉及超高效液相色谱法主要是测定除DINP，DIDP以外的几种PAEs。如郑和辉［8］等采用超高效液相色谱法检测化妆品中4种邻苯二甲酸酯，以及柳玉红［9］等采用超高效液相色谱法同时测定化妆品中9种邻苯二甲酸酯和双酚A，都未涉及DINP和DIDP。现有文献关于液相色谱法测定唇膏中PAEs，通常采用甲醇或乙腈作为提取剂［8-12］，且样品称取后直接加入提取剂，未考虑唇膏在甲醇或乙腈中不宜溶解分散，进而导致提取不充分的情况。

笔者将唇膏涂覆在滤纸上，用甲醇浸泡超声提取，从而避免由于样品粘连不宜分散导致提取不充分的问题。采用超高效液相色谱法相比普通高效液相色谱法，在分析速度、分离度和灵敏度上有更好的表现，整个检测过程在13 min内完成，普通高效液相色谱法需要45 min以上［16-17］。

1　实验部分

1.1主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪（UPLC）：Waters Acquity型，带PDA检测器、Empower 色谱工作站，美国Waters公司；

涡旋混匀器：MS 3digital型，德国IKA集团；

高速离心机：H1650型，长沙湘仪离心机仪器有限公司；

超声波清洗器：AS3210型，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；

邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二戊酯（DPP）、邻苯二甲酸二己酯（DHXP）：纯度分别为99%，98%，98%，98%，上海安谱实验科技股份有限公司；

邻苯二甲酸二丙酯（DPRP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸丁基苄基酯（BBP）、邻苯二甲酸二（2乙基）己酯（DEHP）、邻苯二甲酸二正辛酯（DNOP）：纯度分别为98%，99%，99.5，99.6%，99%，德国Dr.Ehrensorfer公司；

邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）、邻苯二甲酸二异癸酯（DIDP）：纯度均为99%，北京曼哈格生物科技有限公司；

甲醇、乙腈：色谱纯，德国Merck公司；

滤纸：定量滤纸，杭州新华纸业有限公司；

实验用水为Mili-Q Water system制备的超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm）。

1.2标准溶液配制

邻苯二甲酸酯各单标溶液：准确称取除DINP和DIDP外其它邻苯二甲酸酯物质各20 mg，移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，各单标浓度均为2 000 mg/L；准确称取DINP和DIDP各100 mg，移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，DINP和DIDP质量浓度均为10.0 g/L。

邻苯二甲酸酯混合标准溶液：准确移取邻苯二甲酸酯各单标溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，获得DINP和DIDP质量浓度为500 mg/L，其它物质的质量浓度为100 mg/L的混合标准溶液。

混合标准工作溶液：分别取0.05，0.1，0.2，0.5，2.0，4.0 mL邻苯二甲酸酯混合标准溶液，用甲醇定容至10 mL，配制成DINP和DIDP质量浓度分别为2.5，5.0，10.0，25.0，100.0，200.0，500.0 mg/L，其它邻苯二甲酸酯质量浓度分别为0.5，1.0，2.0，5.0，20.0，40.0，100.0 mg/L的系列混合标准工作溶液。

1.3色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司）；保护住：VanGuard保护住；检测器：PDA检测器；检测波长：225 nm；流动相：乙腈-水；梯度洗脱程序：初始乙腈-水体积比为55∶45，乙腈比例在2 min内线性增长到70%，从2 min至3 min保持70%等度，3 min至4 min线性增长至85%，4 min至10 min保持95%等度，10 min后恢复初始流动相，保持3 min；流量：0.5 mL/min；进样体积：5 μL；柱温：40℃。

1.4样品处理

将唇膏样品涂覆在已称重的滤纸（20 mm×10 mm）上，单面涂覆，涂覆量在0.1 g左右，一般需要滤纸（20 mm×10 mm）5张左右。将涂覆有样品的滤纸按照非涂覆面与涂覆面叠放的原则，依次叠放滤纸，转移至具塞比色管中，加入10 mL甲醇。涡旋2 min后，常温超声提取20 min，然后将提取液转移到离心管中，在5 000 r/min速度下离心10 min，过0.22 μm滤膜，备用。

2　结果与讨论

2.1样品处理条件的选择

唇膏属于蜡基类膏状物质，称样后直接用甲醇或乙腈提取，样品不易分散，不利于目标物质提取。为使样品与提取液充分接触，提高提取效率，国标［18］方法将称好的唇膏样品置于研钵中，加入海砂5 g，研磨均匀，再转移至具塞三角瓶中，用甲醇超声提取。依照此方法测试发现用海砂研磨唇膏能将样品附着在海砂表面，增加了唇膏与提取剂的接触面积，有利于提取，但是在研磨过程中一部分样品附着在研钵的表面，造成样品损失，影响测定结果。通过反复测试发现，将样品直接涂覆在滤纸上既能增加样品与提取剂的接触面积，同时又不会造成样品的损失。操作如下，将样品涂覆在事先称量好的滤纸（20 mm×10 mm）单面上，涂覆量在0.1 g左右，再将滤纸置于具塞比色管中称量，扣除滤纸的质量，能够准确计算出样品的质量，因此该方法能有效避免样品的损失。称取0.1 g样品，一般需要5张左右滤纸，把涂覆有样品的滤纸叠好置于比色管中时，应按照非涂覆面与涂覆面叠放的原则，依次叠放滤纸，不要将两张滤纸的涂覆面叠放在一起，避免造成粘连而不利于样品的提取。

该方法采用涡旋超声提取方式对样品进行提取。样品在加入提取剂后，先涡旋2 min，利于溶剂充分渗透，再进行超声提取。通过比较超声提取10，15，20 min阳性样品的提取率发现，超声20 min提取效果更好，因此选择超声提取20 min。

同时考察甲醇、乙腈的提取效果发现，唇膏在甲醇相比乙腈更易溶解，且通过对阳性样品的提取实验，得出甲醇的提取效果更好，且甲醇成本和毒性都比较低，因此采用甲醇作为提取剂。

2.2色谱条件的选择

2.2.1洗脱条件的选择

分别对乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙腈-水等流动相进行考察，发现3种流动相都能有效分离出各物质，但是在乙腈-水流动体系下峰形更好，且流速可达0.5 mL/min；而在甲醇-水流动体系下流速为0.30 mL/min，甲醇-乙腈-水流动体系下流速为0.4 mL/min，过高的流速易产生压力过载。同时考察了等度洗脱和梯度洗脱对物质分离的情况，等度洗脱不能有效分离各物质，需要进行梯度洗脱。因此采用乙腈-水梯度洗脱的方法，并对梯度条件进行优化，13 min内完成分离检测。

2.2.2检测波长的选择

通过PDA检测器扫描，分析11种PAEs的光谱图发现，各物质在波长225 nm附近有较大的紫外吸收，因此选取225 nm作为检测波长。

2.3酞酸酯的色谱分析

11种PAEs标准色谱图见图1，检测波长为225 nm，前9种PAEs呈现尖锐且对称的峰形，后两种由于DINP和DIDP是同分异构体的混合物，因而在谱图上呈现“五指峰”的峰形，11种PAEs能够完全分离，各物质的保留时间见表1。阳性唇膏样品色谱图如图2，从图2中可以看出，DEP和DPRP能完全分离，且在其余9种PAEs保留时间处，基质对PAEs干扰较少。即便有些物质对PAEs有干扰，也可以通过紫外光谱图进行鉴别。

图1　种酞酸酯标准样品溶液色谱图

图2　阳性样品溶液色谱图

2.4线性方程及检出限

在1.3色谱条件下对1.2配制的系列混合标准溶液进样测定，以各组分的色谱峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标进行线性回归，线性方程、线性范围及相关系数见表1。

以空白样品的3倍信噪比（S/N）为检出限。11种PAEs的检出限（称样量为0.1 g）见表1。由于DINP和DIDP为同分异构体混合物，色谱峰比较宽，灵敏度比较低，检出限为30 mg/kg，其它9种PAEs检出限不超过3 mg/kg。

表1　线性方程、相关系数和检出限

2.5回收试验和精密度

在0.1 g唇膏中，按两个水平添加11种PAEs的标样，添加量分别为50，10 μg，每组分别重复添加6次，回收试验和精密度试验结果见表2。

表2　添加回收率和精密度（n=6）

从表2可知，添加量为10 μg时，加标回收率为86.6%～97.0%，测定结果的相对标准偏差为1.2%～6.0%；添加量为50 μg时，加标回收率为93.6%～98.6%，测定结果的相对标准偏差为0.6%～2.4%，回收率和精密度能满足检验要求。

3　结语

创新性的采用滤纸分散唇膏样品，提高了甲醇提取酞酸酯的效率，有效解决了国标GB/T 28599-2012中唇膏类样品在样品处理过程中待测物损失的问题，同时该前处理方法也为提取唇膏中其它物质提供参考。研究发现超高效液相色谱法能快速有效检测和分离DMP，DEP，DPRP，DBP，DPP，DHXP，BBP，DEHP，DNOP，DINP，DIDP 11种酞酸酯物质，检测时间仅为13 min。该方法能够实现快速提取并准确测定唇膏中11种酞酸酯。

［1］ 浙江省标准化研究院，义乌出入境检验检疫局.化妆品出口技术性贸易措施应对指南［M］.北京：中国标准出版社，2012.

［2］ 中华人民共和国卫生部.化妆品卫生规范［M］.北京：军事医学科学出版社，2007.

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Determination of 11 kind of Phthalate Esters in Lipstick by Rapid Extraction and Ultra-Performance Liquid Chromatography

Zhou Jiang， Ji Qianyi， Yu Miaoqin， Yang Hao， Wu Chongbin
［Yiwu Product （Commodity） Quality Supervision and Test Institute， Yiwu 322000， China］

A rapid extraction and ultra-performance liquid chromatography method was established for determining 11 kind of phthalate esters（PAEs） in lipstick. The lipstick sample was directly coated on the quantitative filter paper，and extracted by methanol using shaker and ultrasonic bath. PAEs were separated on Waters ACQUITY UPLC BEH C18column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） by gradient elution using acetonitrile-water as the mobile phase at a flow rate of 0.5 mL/min，and detected by PDA detector on detecting wavelength of 225 nm. The detection limits（S/N=3） of dimethyl phthalate and diethyl phthalate were 1 mg/kg and 2 mg/kg， respectively； the detection limits of dipropyl phthalate，dibutyl phthalate，dipentyl phthalate，dihexyl phthalate，benzyl butyl phthalate，bis（2-ethylhexyl） phthalate and di-n-octyl phthalate were 3 mg/kg； the detection limits of di-iso-nonyl phthalate and di-iso-decyl phthalate were 30 mg/kg. The average recoveries for PAEs in lipstick were 86.6%-98.6%. The relative standard deviations of determination results were 0.6%-6.0%（n=6）. The pretreatment is simple，the extraction efficiency is high，and the separation is quick and effective. The method can satisfactory for determination of the 11 phthalate esters in lipstick.

lipstick； phthalate esters； ultra-performance liquid chromatography； quantitative filter paper

O657.7

A

1008-6145（2016）03-0081-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.03.021

联系人：周江；E-mail∶ 8849409@qq.com

2016-02-01