MicroRNA-625在食管鳞癌中的表达及临床意义*

刘莎莎岳冬丽陈新峰平玉张毅

·临床研究与应用·

MicroRNA-625在食管鳞癌中的表达及临床意义*

刘莎莎①②岳冬丽①陈新峰①平玉①②张毅①②

目的：探讨microRNA-625（miR-625）在食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中的表达及其与临床参数的相关性，探究miR-625对ESCC细胞系KYSE70迁移和增殖的影响。方法：实时荧光定量（real-time polymerase chain reaction，PCR）检测2014年2月至2015年4月郑州大学第一附属医院手术切除的86例ESCC及癌旁正常组织、ESCC细胞系和正常永生化食管上皮细胞系中miR-625的表达，统计学分析其表达水平与ESCC患者临床病理参数及预后的相关性。Transwell实验检测miR-625对细胞迁移能力的影响，细胞计数Kit-8（CCK-8）法检测miR-625对细胞增殖的影响。结果：ESCC组织中miR-625的表达明显低于癌旁正常组织（P＜0.05），ESCC细胞系中miR-625表达水平与正常永生化食管上皮细胞相比，显著下调（P＜0.05）。miR-625的表达与肿瘤直径、分化程度及淋巴结转移呈负相关（P＜0.05）。随访数据提示miR-625低表达组患者预后更差（P＜0.05）。miR-625能够抑制ESCC的迁移和增殖（P＜0.05）。结论：miR-625作为抑癌基因参与ESCC的发生发展，提示miR-625可能作为一个ESCC治疗靶点和预后判断的分子标志物。

miR-625 食管鳞癌 迁移 增殖 预后

食管癌作为发病率较高的恶性肿瘤之一已越来越被关注。其发病率和死亡率分别占我国各类肿瘤的第5位和第4位。我国食管癌以食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）为主，占食管癌90%以上［1-2］。尽管随着ESCC的诊断和治疗手段的进步，但因为癌细胞的无限增殖和转移侵袭特性，ESCC患者术后3年和5年生存率仅为43.7%和26.2%［3］。因此，研究ESCC迁移增殖的机制并寻找新的治疗靶点，对提高ESCC的疗效具有重要的临床意义。

miRNA是一类长度约21～25个核苷酸的非编码RNA，在转录后水平调控靶基因的表达。成熟miRNA通过RNA诱导的沉默复合体结合到靶mRNA上，依赖于序列的互补机制，剪切或阻遏靶mRNA，沉默靶基因的表达［4］。事实上，miRNA调节了约30%的蛋白编码基因，并参与多种生物学功能的调控，包括细胞增殖、凋亡及分化。因此，miRNA的功能异常与人类多种疾病相关。大量的研究发现，多种miRNA与肿瘤的发生及转移等过程相关［5］。因此，miRNA成为治疗原发肿瘤并同时抑制肿瘤转移的有效靶点及治疗工具。研究发现，miR-625能够通过调节ILK基因抑制胃癌的侵袭转移［6］；miR-625的低表达与多种肿瘤转移及不良预后有关［7］。但miR-625在ESCC中的报道相对较少，所以本研究从临床方面，研究ESCC组织及ESCC细胞系中miR-625表达情况，以及miR625与ESCC患者生存预后的相关性并探讨miR625与ESCC增殖转移的关系。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1标本收集2014年2月至2015年4月郑州大学第一附属医院手术切除的新鲜ESCC标本及相对应的正常标本86例，所有组织都经病理学确诊，患者在术前均未行放、化疗。标本采集后，采用液氮速冻，然后于-80℃储存以备提取组织总RNA。组织标本的收取均已获得郑州大学第一附属医院伦理委员会批准，并签署知情同意书。所有受试对象均参加每3个月1次的随访计划，随访采用电话随访方式与患者或家属取得联系。

1.1.2细胞正常永生化食管上皮细胞系Het-1α和人ESCC细胞系KYSE70、KYSE450、EC109、EC9706、TE1均由本研究课题组实验室保存。

1.1.3主要试剂RPMI 1640培养液购自美国Hy-Clone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司；RNAiso plus、cDNA逆转录试剂盒及SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ均购自日本TAKARA公司；miR625 mimics和inhibitor由上海吉玛设计；Real time PCR引物由上海生工合成。

Het-1α、KYSE70、KYSE450、EC109、EC9706和TE1均为贴壁细胞，培养于含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基中，在37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3实量定量PCR检测miR-625的表达

RNAiso plus法提取Het-1α及ESCC细胞和ESCC组织中总RNA，Nanodrop 2000分光光度计检测RNA纯度及浓度。OD260/280比值在1.80～2.00之间，符合实验要求。按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，按SYBR Green试剂说明书于实时荧光定量PCR仪进行扩增。PCR引物为miR625上游引物为5'-AGGGGG AAAGTTCTATAGTCC-3'，通用下游引物为5'-TGGT GTCGTGGAGTCG-3'。内参U6上游为5'-CTCGCTT CGGCAGCACA-3'，内参U6下游为5'-AACGCTTCA CGAATTTGCGT-3'。

1.4脂质体瞬时转染

转染前24 h铺KYSE70细胞，待细胞融合至70%～80%时，用Lipofectamine 3000转染miR625类似物（mimics）、mimics对照和miR625抑制剂（inhibitor）、inhibitor对照，24 h后收细胞，进行后续实验。

1.5Transwell实验检测细胞迁移能力

取转染过的KYSE70细胞，以每4×104个/mL的密度将细胞接种于8 μm Transwell板的上室，下室加入含10%胎牛血清的完全培养液600 μL，于37℃、5%CO2培养箱培养24 h，再经甲醇固定，0.1%结晶紫染色后，于显微镜下随机选取5个视野（×200）观察并拍照，计数每个视野中穿过滤膜的细胞数。

当短路故障电流流过故障指示器时会上报故障信息，由于配电网呈单电源辐射状运行，因此当故障指示器有故障信息上报时，则可知故障一定在故障指示器下游。若故障指示器没有故障信息上报时，则可知故障一定在故障指示器上游。所以根据故障指示器上报的故障信息，均可提供一种可疑故障区段的证据。

1.6CCK8检测细胞增殖能力

96孔板每孔铺5×103个经转染过的细胞，分别在24、48、72、96 h加入10 μL CCK-8溶液，混匀，细胞培养箱内继续培养1 h后，酶标仪450 nm波长测吸光度值。

1.7统计学分析

应用SPSS 17.0统计学软件分析实验数据。采用student's t检验，配对样本采用配对t检验。生存分析采用Kaplan-Meier法。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1在ESCC组织中及食管癌细胞系中miR-625低表达

通过Real-time PCR检测86对ESCC组织及癌旁正常组织中miR-625的mRNA表达水平。结果显示，miR-625在ESCC组织中的表达明显低于癌旁正常组织（P＜0.001，图1A）。同时检测正常永生化食管上皮细胞系Het-1α及6种ESCC细胞系中miR-625的mRNA表达水平，结果同样显示，miR-625在6种ESCC细胞系中的表达明显低于Het-1α，差异具有统计学意义（P＜0.05，图1B）。

2.2miR-625表达与肿瘤临床病理参数相关性分析

86例ESCC患者miR-625表达水平与肿瘤病理参数分析结果显示，其表达与肿瘤淋巴结转移情况、分化及肿瘤大小呈负相关，差异具有统计学意义（P＜0.05，表1）。

2.3miR-625表达与患者生存预后的关系

miR-625高表达及低表达组的化疗比例分别为45%（19/42），34%（15/44）（P=0.291）；miR-625高表达及低表达组的放疗比例分别为31%（13/42），36%（16/ 44）（P=0.596），高表达和低表达组放化疗比例相近，无显著性差异，具有较好的可比性生存分析结果表明miR-625高表达患者中位生存时间为23个月，低表达患者中位生存时间为16.5个月。Kaplan-Meier单因素分析显示miR-625表达与ESCC患者总生存相关。差异具有统计学意义。（P=0.000 9；95%CI：0.124 6～0.586 9；HR=0.270 4）（图2）。

图1　miR-625在ESCC组织中及食管癌细胞系中的表达Figure 1miR-625 expression in ESCC tissues and cell lines

图2　miR-625的表达与ESCC患者生存的关系Figure 2miR-625 expression and prognosis in ESCC patients

2.4miR-625抑制ESCC细胞的迁移能力

将miR-625 miR-625模拟物和抑制剂成功转染到KYSE70细胞系后，Transwell实验结果显示，和对照组相比，miR-625模拟物组的KYSE70细胞迁移能力明显受到抑制（图3A），而miR-625抑制剂组的KYSE70细胞的迁移能力明显增强（图3A），差异具有统计学意义（P＜0.05，图3B）。体外Transwell结果表明，miR-625能够抑制ESCC细胞的迁移。

2.5miR625抑制ESCC细胞的增殖能力

为了进一步检测miR-625对ESCC细胞体外增殖能力的影响，本研究采用CCK-8实验分别检测转染过miR-625模拟物组和miR-625抑制剂组KYSE70细胞的体外增殖能力。结果显示，与miR-625模拟物对照组相比，过表达miR-625的KYSE70细胞的增殖能力明显下调（图4A）。与抑制剂对照组相比，敲低miR-625的KYSE70细胞的增殖能力明显升高（图4B），差异具有统计学意义（P＜0.05）。体外CCK-8结果表明，miR-625能够抑制ESCC细胞系的增殖。

表1　ESCC患者miR-625表达量与临床病理参数的相关性Table 1Correlation between the clinicopathological characteristics and miR-625 expression in 86 ESCC patients

图3　miR625对ESCC细胞迁移的影响Figure 3Effect of miR-625 on ESCC cell migration

图4　miR-625对ESCC细胞系增殖的影响Figure 4Effect of miR-625 on ESCC cell proliferation

3 讨论

食管癌是最常见的消化道系统恶性肿瘤之一，对人类的生活和健康造成严重的威胁。目前认为，浸润转移是晚期ESCC的重要死因之一［8］。因此进一步研究食管癌侵袭和转移机制，显得尤为重要。

随着科学的发展，曾经被忽视的一类小分子的非编码RNA-miRNA越来越受到关注，甚至成为生命研究的热点。miRNA约占整个基因组的1%，却能调控30%的基因的表达。已有大量研究表明miRNA能够调控肿瘤的侵袭转移。miR-656能够通过抑制BMP-2蛋白受体来抑制脑胶质瘤细胞的增殖、侵袭、转移［9］；miR-612能够抑制肝细胞癌的侵袭转移［10］；miR-140可以通过靶向TGFBR1和FGF9抑制肝细胞癌的生长和转移［11］；miR-300通过靶向Twist蛋白抑制食管癌的上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）过程，EMT赋予细胞侵袭和转移能力［12-15］。miR-21能够通过下调肿瘤抑制性基因Pdcd4的表达进而促进结直肠癌的侵袭转移特性［16］；miR-139能够通过靶向Ⅰ型胰岛素样生长因子受体抑制结直肠癌的侵袭转移［17］；miR-331-3p通过靶向PHLPP促进肝癌的增殖及转移［18］。其中，研究发现miR-625的下调能够促进食管癌的增殖和侵袭［19］。这与本研究结果相一致，本研究进一步分析ESCC中miR-625的表达及其与临床预后的关系，将miR-625的表达与临床参数紧密联系，为miR-625作为治疗ESCC的潜在靶点提供更加充实的临床依据。

本研究结果表明miR-625在ESCC组织和ESCC细胞系中表达明显低于癌旁正常组织及正常永生化食管上皮细胞系。miR-625的表达与淋巴结转移、分化程度及肿瘤大小呈负相关，miR-625高表达的患者生存时间明显长于miR-625低表达。这些结果提示miR-625在ESCC的发生发展中发挥重要作用。为了明确miR-625在ESCC增殖转移中发挥的重要作用，进行细胞增殖实验及Transwell实验。当ESCC细胞中miR-625过表达时，能够显著抑制肿瘤细胞的迁移和增殖能力。相反，抑制miR-625的表达可促进细胞增殖及迁移能力。Zhou等［20］在分析乳腺癌组织时发现miR-625较正常对照组显著上调，且发现miR-625能够抑制癌细胞的增殖及迁移。有研究发现miR-625通过调控IGF2BP1/PTEN通路，从而抑制肝癌的转移，在肝癌的发生发展中发挥重要作用［21］。这与本研究结果基本一致。上述研究结果提示miR-625在ESCC的发生发展中发挥着抑癌基因的功能。

综上所述，miR-625在ESCC的发生发展中发挥着抑癌基因的功能，其低表达与淋巴结转移、分化及不良预后相关，且miR-625可抑制ESCC细胞的增殖及迁移能力，提示了miR-625可能是ESCC转移标志物及治疗靶点，为改善ESCC的诊治提供新的实验依据。

［1］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（1）:33-64.

［2］Hao J，Shao K.Statusofepidemiology，diagnosis and treatment of esophageal cancerandfuturecountermeasure in China［J］.Chin J cancer，2011，21（7）:501-504.［赫捷，邵康.中国食管癌流行病学现状、诊疗现状及未来对策［J］.中国癌症杂志，2011，21（7）:501-504.］

［3］Jiang Y，Chen S，Zhu B.Prognostic factors and family history for survival of esophageal squamous cell carcinoma patients after surgery［J］.Ann of Thorac Surg，2010，90（3）:908-913.

［4］Billeter AT，Barnett RE，Druen D，et al.MicroRNA as a new factor in lung and esophageal cancer［J］.Semin Thorac Cardiovasc Surg，2012，24（3）:155-165.

［5］Bartel DP.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions［J］.Cell，2009，136（2）:215-233.

［6］Wang M，Li C，Nie H，et al.Down-regulated miR-625 suppresses invasion and metastasis of gastric cancer by targeting ILK［J］.FEBS Lett，2012，586（16）:2382-2388.

［7］Tili E，Michaille JJ，Croce CM.MicroRNAs play a central role in molecular dysfunctions linking inflammation with cancer［J］.Immun Rev，2013，253（1）:167-184.

［8］Yue D，Zhang Z，Li J，et al.Transforming growth factor-beta1 promotes the migration and invasion of sphere-forming stem-like cell subpopulations in esophageal cancer［J］.Exp Cell Res，2015，336（1）:141-149.

［9］Guo M，Jiang Z，Zhang X，et al.MiR-656 inhibits glioma tumorigenesis through repression of BMPR1A［J］.Carcinogenesis，2014，35（8）:1698-1706.

［10］Tao ZH，Wan JL，Zeng LY，et al.MiR-612 suppresses the invasive-metastatic cascade in hepatocellular carcinoma［J］.J Exp Med，2013，210（4）:789-803.

［11］Yang H，Fang F，Chang R，et al.MicroRNA-140-5p suppresses tumor growth and metastasis by targeting transforming growth factor beta receptor 1 and fibroblast growth factor 9 in hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2013，58（1）:205-217.

［12］Yu J，Xie F，Bao X，et al.miR-300 inhibits epithelial to mesenchymal transition and metastasis by targeting Twist in human epithelial cancer［J］.Mol Cancer，2014，13（1）:69-74.

［13］Yuan XW，Wang DM，Hu Y，et al.Hepatocyte nuclear factor 6 suppresses the migration and invasive growth of lung cancer cells through p53 and the inhibition of epithelial-mesenchymal transition［J］.J Biol Chem，2013，288（43）:31206-31216.

［14］Gregory PA，Bracken CP，Bert AG，et al.MicroRNAs as regulators of epithelial-mesenchymal transition［J］.Cell Cycle，2008，7（20）:3112-3118.

［15］Yao D，Dai C，Peng S.Mechanism of the mesenchymal-epithelial transition and its relationship with metastatic tumor formation［J］. Mol Cancer Res，2011，9（12）:1608-1620.

［16］Asangani IA，Rasheed SA，Nikolova DA，et al.MicroRNA-21（miR-21）post-transcriptionally downregulates tumor suppressor Pdcd4 and stimulates invasion，intravasation and metastasis in colorectal cancer［J］.Oncogene，2008，27（15）:2128-2136.

［17］Shen K，Liang Q，Xu K，et al.MiR-139 inhibits invasion and metastasis of colorectal cancer by targeting the type I insulin-like growth factor receptor［J］.Biochem Pharmacol，2012，84（3）:320-330.

［18］Chang RM，Yang H，Fang F，et al.MicroRNA-331-3p promotes proliferation and metastasis of hepatocellular carcinoma by targeting PH domain and leucine-rich repeat protein phosphatase［J］.Hepatology，2014，60（4）:1251-1263.

［19］Wang Z，Qiao Q，Chen M，et al.MiR-625 down-regulation promotes proliferation and invasion in esophageal cancer by targeting Sox2［J］.FEBS Lett，2014，588（6）:915-921.

［20］Zhou WB，Zhong CN，Luo XP，et al.MiR-625 suppresses cell proliferation and migration by targeting HMGA1 in breast cancer.［J］.Biochem Biophys Res Commun，2016，470（4）:838-844.

［21］Zhou X，Zhang CZ，Lu SX，et al.miR-625 suppresses tumour migration and invasion by targeting IGF2BP1 in hepatocellular carcinoma［J］.Oncogene，2014，34（8）:965-977.

（2016-06-06收稿）

（2016-09-13修回）

（编辑：周晓颖校对：孙喜佳）

刘莎莎专业方向为肿瘤免疫、肿瘤微环境的研究。

E-mail：liushasha910729@163.com

Clinical significance of microrna-625 expression in esophageal squamous cell carcinoma

Shasha LIU1，2，Dongli YUE1，Xinfeng CHEN1，Yu PING1，2，Yi ZHANG1，2
Correspondence to:Yi ZHANG；E-mail:yizhang@zzu.edu.cn

1Biotherapy Center，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China；2School of Life Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，China

This work was supported by the Foundation for Science and Technology Program of Ministry of Public Health，Henan Province，China（No.201501004）

Objective:To analyze the correlation of miR-625 expression with clinicopathological characteristics in esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）and to explore the effect of miR-625 on the migration and proliferation of ESCC cells.Methods:The expression level of miR-625 was determined through real-time PCR in 86 paired human ESCC tissue specimens and tumor-adjacent normal esophageal tissue specimens，ESCC cell lines，and esophageal epithelial cell line.The associations of miR-625 expression with clinicopathological characteristics and survival in ESCC patients were analyzed.Transwell and CCK-8 assays were performed to examine the effect of miR-625 expression on migration and proliferation of ESCC cells.Results:Compared with tumor-adjacent normal specimens，miR-625 was significantly downregulated in ESCC tissue specimens（P＜0.05）.MiR-625 expression was decreased in ESCC cell lines compared with human esophageal epithelial cell lines（P＜0.05）.Lower miR-625 expression was associated with poorer prognosis and survival.The migration and proliferation abilities of ESCC cells were inhibited by miR-625 overexpression（P＜0.05）.Conclusion:MiR-625 acts as a tumor suppressor gene in the development and progression of ESCC，suggesting that miR-625 may serve as an efficient prognosis biomarker and a potential therapeutic target for ESCC.

miR-625，ESCC，migration，proliferation，prognosis

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.18.656

①郑州大学第一附属医院生物治疗中心（郑州市450052）；②郑州大学生命科学学院

*本文课题受卫生部科技攻关项目（编号：201501004）资助

张毅yizhang@zzu.edu.cn