大鼠脑缺血再灌注后大脑海马区自噬的研究

赵亚倩，黄国伟，陈　爽，苟　芸，张绪梅



大鼠脑缺血再灌注后大脑海马区自噬的研究

赵亚倩，黄国伟，陈爽，苟芸，张绪梅

目的检测大鼠脑缺血再灌注后海马神经细胞损伤及自噬变化，并比较海马CA1及CA3区的自噬情况。方法用线栓法制作大鼠脑局部缺血再灌注模型，实验动物随机分为：对照组(Control组)、假手术组(Sham组)和大脑中动脉栓塞再灌注组(MCAO组)。HE染色检测大鼠海马神经细胞损伤。透射电镜下观察海马神经元内自噬小体。免疫荧光法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1的表达水平。结果与Control组及Sham组比较，大鼠脑缺血再灌注后，海马神经细胞损伤严重；海马神经元内有自噬体形成；自噬标记物LC3、Beclin-1蛋白表达水平显著增加，且CA1区的表达量明显高于CA3区(差异均具有统计学意义P<0.05)。结论脑缺血再灌注可激活海马神经细胞内的自噬,并进一步引起细胞损伤；模型动物海马CA1区的自噬水平显著高于CA3区，暗示CA1区对脑缺血损伤具有较高的敏感度。

缺血再灌注；自噬；海马；LC3；Beclin-1

随着社会人口的老龄化，作为老年病的卒中已经成为人类死亡的三大病因之一。卒中的病理机制报道有很多，其中涉及到缺血缺氧引起的细胞能量代谢障碍、兴奋性氨基酸的神经毒性、胞内钙超载、氧自由基和NO损伤以及炎症反应等[1]。近年来研究发现自噬在脑梗死等中枢神经系统疾病病理过程中发挥着重要作用。自噬是细胞的一种高度保守降解途径，通过隔离膜包裹细胞质和(或)细胞器等物质形成自噬体，再通过微管系统与溶酶体结合成自噬溶酶体，并降解包裹的物质[2]。国内外已有研究报道脑缺血后神经细胞内存在自噬现象[3,4]，但为了对疾病的发生发展有更深入的认识，尚需对其进一步进行定位、定量研究。

海马是大脑中对缺血缺氧损伤极敏感的区域，已有研究证实海马CA1区锥体神经元对缺血性损伤十分敏感，而CA3区和DG区则对缺血性刺激相对耐受[5]。这暗示脑缺血处理可能激活了海马各亚区不同的分子机制[6]。国内外已有学者进行了脑缺血再灌注后海马自噬情况的研究，但是这些研究大多仅针对海马整个组织或CA1区[7,8]，对海马CA1区和CA3区的对比研究鲜有报道。本实验拟检测大鼠脑缺血再灌注后海马神经细胞的损伤及自噬情况，并比较海马CA1及CA3区的自噬相关蛋白LC3、Beclin-1的表达水平，为脑缺血再灌注损伤机制的深入研究提供理论基础。

1　材料和方法

1.1实验动物与分组SPF级雄性SD大鼠60只，重量210～230 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物饲养合格证号:SCXK(京)2012-0001。按体重随机分为对照组(Control组)、假手术组(Sham组)、大脑中动脉栓塞再灌注组(MCAO组)，每组20只。大鼠适应7 d后造模。再灌注24 h及72 h后处死大鼠取材。

1.2药品与试剂兔抗大鼠Beclin-1多克隆抗体(abcam公司，货号：ab55878)，兔抗大鼠LC3B多克隆抗体(CST公司，货号：#2775)，FITC标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥科技有限公司)，柠檬酸钠-EDTA抗原修复液及抗荧光淬灭封片剂(碧云天生物技术研究所)，即用型山羊血清(博士德生物)，其他常用试剂均为国产分析纯。

1.3大脑中动脉栓塞再灌注模型的建立采用改良Longa法[9]制备大鼠大脑局灶性脑缺血再灌注模型，用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉大鼠，仰卧位固定于手术台上，颈部正中纵向切口，逐层分离。暴露左侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)和迷走神经。钝性分离CCA和迷走神经。找到左侧颈外动脉(external carotid artery，ECA)和颈内动脉(internal carotid artery，ICA)分叉，分离ECA，ICA，用缝合线结扎ECA近分叉端。在近心端和分叉前分别用动脉夹夹闭CCA，在距动脉分叉5 mm处用1 ml注射器针头，扎开小口，插入栓线，松开分叉前动脉夹，栓线缓慢向ICA插入，继续将栓线缓慢向ICA入颅方向推进，至有阻力不能再进为止，插线长度约18～20 mm(从分叉处算)。用缝合线将栓线与CCA结扎固定，松开近心端动脉夹。1 h后栓线拔出1 cm，剪短露在外面的栓线。手术过程中严格遵守无菌操作规范。术后大鼠放入鼠盒中(垫料经高压处理)，白炽灯照射对其保温，保持干燥，密切观察。假手术组除不进线外，其余过程同模型组。

1.4神经功能评分按照Longa提出的5分制评分标准[9]。评分在1～3分为有效模型，0分和4分则剔除，模型在后续实验中随机补全，以保证每组动物数不变。

1.5电镜切片制备再灌注24 h，每组随机取3只大鼠断头取脑，冰上分离出梗死侧海马，将海马切成1 mm3的小块，迅速置于2.5%戊二醛中固定4 h，1%锇酸后固定，常规梯度丙酮脱水，Epon812包埋，半薄切片选区，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重电子染色，透射电镜(HT-7700；Hitachi)下观察。

1.6石蜡切片制备各组大鼠在相应时间点(再灌注24 h-免疫荧光，再灌注72 h-HE)水合氯醛麻醉下，经心脏灌注生理盐水250 ml后，灌注300 ml 4%中性多聚甲醛。灌注后取出左侧脑组织，4%的中性多聚甲醛固定过夜。梯度蔗糖脱水，常规石蜡包埋。将脑组织以梗死灶为中心冠状切开，包括皮质、海马等，连续切片，厚度为6 μm。

1.7HE染色各组随机选取3只大鼠石蜡切片进行HE染色，每只大鼠取大脑梗死侧冠状切片(隔4取1)6张，光镜(IX81；Olympus)下拍摄大鼠海马照片。

1.8免疫荧光检测依次进行脱蜡、水化、H2O2室温封闭10 min、枸橼酸抗原修复、山羊血清37 ℃封闭40 min、滴加一抗(LC3 1∶400，Beclin-1 1∶200)4 ℃过夜、相应二抗(山羊抗兔1∶100)25 ℃孵育1 h，抗荧光淬灭封片剂封片后荧光显微镜(IX81；Olympus)下观察并拍照。Image Pro Plus计数阳性细胞。

2　结　果

2.1病理形态学观察HE染色结果显示，缺血再灌注72 h后，Control组及Sham组大鼠大脑海马神经细胞排列整齐，胞核大而圆。MCAO组神经细胞数量减少，排列紊乱，细胞间隙增宽，胞核固缩，可见脑缺血再灌注对神经细胞造成了明显损伤。

2.2海马神经元超微结构变化Control组及Sham组大鼠海马神经元胞核呈圆形或椭圆形，核膜清晰完整，染色质呈细颗粒状，均匀分布，胞浆内可见丰富的细胞器，线粒体呈椭圆形或杆状，线粒体嵴发达，粗面内质网散在分布，可见大量游离核糖体。MCAO组神经元可见染色质呈团块状边集于核膜下，线粒体肿胀，球形线粒体多见，线粒体嵴断裂，粗面内质网囊性变，胞浆内游离核糖体明显减少，可观察到内腔包裹有吞噬物的游离双层或多层膜结构(即自噬小体)，包裹的吞噬物为形态尚完好或已降解的细胞质或细胞器。

2.3缺血再灌注对自噬标记物LC3和Beclin-1蛋白表达的影响LC3免疫荧光结果显示，缺血再灌注24 h后，Control组及Sham组大鼠脑海马区有少量的LC3蛋白表达阳性细胞(呈绿色荧光)。与Control组及Sham组相比，MCAO组LC3阳性细胞显著增多，差异有统计学意义(P<0.05)。将MCAO组海马CA1区与CA3区LC3阳性细胞分别计数结果显示，CA1区阳性细胞显著多于CA3区，且差异有统计学意义(P<0.05)。Beclin-1免疫荧光结果显示，缺血再灌注24 h后，Control组及Sham组大鼠脑海马区有少量的Beclin-1蛋白表达阳性细胞(呈绿色荧光)。与Control组及Sham组相比，MCAO组Beclin-1阳性细胞显著增多，差异有统计学意义(P<0.05)。将MCAO组海马CA1区与CA3区Beclin-1阳性细胞分别计数结果显示，CA1区阳性细胞显著多于CA3区，且差异有统计学意义(P<0.05)。

3　讨　论

自噬是机体清除过量、老化蛋白质及受损细胞器的重要途径。适度的自噬是细胞完成自身代谢和细胞器更新的重要方式，对维持机体内环境稳定，以及调控细胞损伤和老化具有重要意义。多数研究认为自噬的过度激活可导致细胞程序性死亡，从而引起一系列疾病过程[10]。Koike等利用小鼠大脑缺血缺氧模型，发现海马锥体细胞层有自噬体的形成及海马神经元广泛死亡，而自噬相关基因Atg7缺陷小鼠的神经元死亡显著减少[11]，说明自噬的激活在神经元死亡过程中起重要作用。本研究我们采用大鼠MCAO模型发现脑缺血再灌注后海马神经细胞损伤严重，且在神经细胞内观察到较多的自噬小体，表明脑缺血再灌注激活了神经细胞内自噬，进而导致神经细胞的损伤，这与Koike等的报道一致。

自噬小体的形成可能涉及多种蛋白表达的改变，如LC3、Beclin-1、组织蛋白酶(Cathepsin)、P62蛋白及溶酶体相关蛋白等。研究发现，自噬的整个过程是由自噬相关基因(autophagy-related gene，Atg)家族调控。LC3是酵母菌自噬基因(Atg7/Atg8)在哺乳动物中的同源物，在自噬过程中与降解后的自噬小体膜的形成密切相关。Beclin-1作为酵母Atg6的同源物，可调控自噬前体和自噬体形成。强强等用四血管法制作大鼠全脑缺血再灌注模型，发现大鼠全脑缺血再灌注损伤后海马自噬相关蛋白Beclin-1表达上调[7]。本研究用线栓法制作大鼠局部脑缺血再灌注模型，结果显示，脑缺血损伤后海马区LC3和Beclin-1蛋白表达均显著提高，说明MCAO组电镜观察到的自噬小体的形成与脑损伤激活两种蛋白表达有关。

CA1、CA3、DG是目前应用最多的海马分区。已有研究证实海马各区对缺血的敏感性存在较大差异，Schmidt-Kastner等发现在短暂的缺血处理后,CA1区的锥体神经元几乎全部死亡，而CA3区、DG区神经元几乎不受影响[5]，推测细胞内不同分子机制的激活可能造成缺血缺氧后细胞损伤程度的差异。本研究免疫荧光结果显示，CA1区自噬标记物LC3及Beclin-1蛋白表达水平均显著高于CA3区，说明脑缺血再灌注引起脑损伤可能主要是因为激活了海马CA1区的自噬。海马亚区自噬相关蛋白表达的差异可能是造成其对脑缺血损伤具有不同敏感度的重要原因之一。

本研究证实脑缺血再灌注可提高海马区LC3、Beclin-1蛋白表达水平，激活神经细胞内的自噬，并进一步引起细胞损伤。且模型动物海马CA1区的自噬相关蛋白LC3、Beclin-1表达水平显著高于CA3区，暗示CA1区对脑缺血损伤具有较高的敏感度。但脑缺血再灌注如何调控CA1与CA3区LC3、Beclin-1蛋白的表达差异尚有待于更进一步研究。

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[11]Koike M,Shibata M,Tadakoshi M,et al.Inhibition of autophagy prevents hippocampal pyramidal neuron death after hypoxic-ischemic injury[J].Am J Pathol,2008,172(2):454-469.

Study on the autophagy of hippocampus after focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

ZHAOYaqian,HUANGGuowei,CHENShuang,etal.

(DepartmentofNutritionandFoodHygiene,SchoolofPublicHealth,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

ObjectiveTo investigate the damage of hippocampal neural cells,the changes of autophagy and the difference of autophagy between the CA1and CA3region of hippocampus after cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.MethodsThe focal cerebral ischemia-reperfusion model was induced by an intraluminal filament embolism.The SD rats were randomly divided into 3 groups:the control group (Control group),the sham-operated group (Sham group) and the middle cerebral artery occlusion- reperfusion group (MCAO group).HE staining was employed to detect the damage of hippocampal neurons in rats.The formation of autophagosomes in hippocampal neurons was observed by using transmission electron microscope.The expression levels of autophagy related protein Beclin-1 and LC3 in hippocampus CA1and CA3region was detected by immunofluorescence assay.ResultsThe hippocampal neurons in ischemia brains were damaged seriously and the formation of autophagosomes were detected by transmission electron microscope.Compared with Control group and Sham group,the results by immunofluorescence showed that the expression of LC3 and Beclin-1 protein in hippocampus neurons were significantly increased,and the expression in CA1region was significantly higher than that in CA3region (P<0.05).ConclusionCerebral ischemia-reperfusion can activate autophagy in hippocampal neurons,and further cause cell damage.The level of autophagy of CA1region of the model animals was significantly higher than that of CA3region,suggesting that CA1region had a high sensitivity to cerebral ischemia injury.

Ischemia-reperfusion injury;Autophagy;Hippocampus;LC3;Beclin-1

1003-2754(2016)04-0320-03

2015-12-07；

2016-03-29

国家自然科学基金(No.81373003)；中国博士后科学基金(No.2014M550148)

(天津医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学系，天津 300070)

张绪梅，E-mail：zhangxumei@tmu.edu.cn

R743.3

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