阿托伐他汀对大鼠颈动脉粥样硬化易损斑块及hs-CRP和MMP-9表达的影响

郭恩会，路青山，杨霄鹏，许春阳，王一凡，张豪杰，杨幸文



阿托伐他汀对大鼠颈动脉粥样硬化易损斑块及hs-CRP和MMP-9表达的影响

郭恩会1，路青山1，杨霄鹏1，许春阳1，王一凡1，张豪杰2，杨幸文1

目的研究阿托伐他汀对大鼠颈内动脉粥样硬化易损斑块面积、数目及对基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达和血清hs-CRP的影响。方法将48只健康雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、常规剂量组、强化剂量组，14 w后采血测量hs-CRP,光镜下观察颈内动脉粥硬化易损斑块病理学变化，计数易损斑块数目及面积，采用免疫组织化学法检测易损斑块中MMP-9的表达。结果与模型组相比，常规剂量组和强化剂量组易损斑块计数、面积大小、MMP-9表达均明显降低(P<0.01)，强化剂量组又低于常规剂量组(P<0.05)，强化剂量组和常规剂量组血清hs-CRP测定结果均明显低于模型组(P<0.01)，强化剂量组又低于常规剂量组(P<0.05)。结论阿托伐他汀能够稳定及减少颈内动脉粥样硬化易损斑块的形成和进展，对血清hs-CRP及MMP-9的表达具有抑制作用，并且其抑制作用与剂量具有量效关系。

颈动脉粥样硬化；阿托伐他汀；易损斑块；基质金属蛋白酶-9

心脑血管疾病在我国已成为发病率和病死率第一的疾病，动脉粥样硬化(AS)是其最常见的病因[1]，颈内动脉粥样硬化是全身动脉硬化的重要局部表现，颈内动脉粥样硬化易损斑块的突然破裂及血栓形成是脑梗死的重要发病机制之一[2]，对于通过稳定和逆转颈内动脉粥样硬化易损斑块而降低脑缺血卒中风险是目前临床研究的重点。

高敏C反应蛋白(hs-CRP)是血管炎症的敏感标志物，是与动脉粥样硬化发生、演变和进展有关的促炎因子[3]，作为基质金属蛋白酶家族重要成员之一的MMP-9的高度表达可通过介导血管中膜平滑肌细胞的迁移、增值、凋亡及细胞外基质降解而参与动脉粥样硬化的发生发展，并通过降解纤维帽内胶原纤维及结蹄组织致使纤维帽变薄而形成易损斑块[4,5]，故MMP-9水平高度表达可作为颈内动脉粥样硬化斑块稳定性的检测指标。

阿托伐他汀可降低炎性反应、抗动脉粥样硬化、稳定斑块改善缺血性脑血管疾病，本研究旨在通过建立大鼠颈内动脉粥样硬化及其易损斑块模型，观察不同剂量阿托伐他汀对颈内动脉粥样硬化易损斑块的稳定及逆转是否具有明显差异。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物健康雄性SD大鼠48只，体重200～250 g，(1～2月龄)，由郑州大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(豫)2010-0002。随机分为4组(A、对照组，12只；B、模型组，12只；C、常规剂量组，12只；D、强化剂量组，12只)，饲料由河南省实验动物中心提供，实验大鼠在郑大二附院专用动物房喂养，饲养环境符合SPF级实验条件要求。

1.1.2药物及主要试剂阿托伐他汀(立普妥)由辉瑞制药有限公司提供，批准文号：H20130103。MMP-9免疫组织化学染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2实验方法

1.2.1动物模型建立与实验分组模型组、常规剂量组、强化剂量3组大鼠均参照Wilgram等[6]的方法，建立AS模型，按813 g/kg基础饲料，5 g/kg胆酸钠，30 g/kg胆固醇，50 g/kg白糖，10 g/kg猪油，2 g/kg丙基硫氧嘧啶，配制成高脂饲料，饮水不限，A组大鼠饲养普通饲料；B、C、D 3组大鼠在喂食前腹腔注射VitD3(70万U/kg)，分3 d给完，隔天一次，每隔1 m追加一次VitD3(30万U/kg)。B、C、D 3组大鼠每天给予高脂饲料约15 g，同时分别给予C组大鼠阿托伐他汀5 mg/kg·d、D组大鼠10 mg/kg·d溶于1 ml生理盐水中灌胃，A、B组给予同等容量的生理盐水灌胃，饲养同时定期检测大鼠体重及健康状况，持续14 w。喂养12 w后处死各组大鼠各一只手术切取左侧颈内动脉2 cm，10%甲醛固定、石蜡包埋连续切片HE染色，光镜下观察到B、C、D 3组大鼠切片颈内动脉硬化的病理特征已出现，说明造模成功。

1.2.2hs-CRP测定各组大鼠喂养至14 w末禁食12 h，于尾静脉取血2 ml，6000 r/min离心5 min，取上层血清，由日本DLYMPUS公司生产的AD2700全自动生化测试仪检测血清hs-CRP水平。

1.2.3病理形态学和免疫组织化学检测麻醉取血后，手术取各组大鼠双侧颈内动脉各2 cm，用10%甲醛常规固定，常规石蜡包埋、切片，偶数张HE染色，光学显微镜观察血管病理形态改变，用图像分析仪测量各组斑块总面积及斑块面积/动脉总面积，并计量易损斑块数。奇数张切片行MMP-9免疫组化染色，MMP-9免疫组化染色严格按其试剂盒说明书操作。

2　结　果

2.1血清hs-CRP水平检测模型组血清hs-CRP水平均明显高于常规剂量组和强化剂量组(P<0.01)，且常规剂量组显著高于强化剂量组(P<0.01)(见表1)。

2.2颈内动脉壁斑块面积的改变手术取大鼠颈内动脉，光学显微镜观察血管病理形态改变，定量分析图像分析仪测量颈内动脉斑块结果发现，模型组斑块总面积及斑块总面积/动脉总面积与对照组比较明显增加(P<0.01)；强化剂量组斑块面积及斑块总面积/动脉总面积比常规剂量组明显减小(P<0.05)；常规剂量组斑块面积及斑块总面积/动脉总面积比对照组明显减小(P<0.05)(见表2)。

2.3动脉粥样硬化斑块特征的观察将各组大鼠颈内动脉切片偶数张行HE染色后光镜下观察，对照组颈内动脉管腔均匀，管壁光滑，模型组颈内动脉管腔明显变窄、内膜明显增厚，内含大量的泡沫细胞及炎症细胞，管壁质地易碎并弹性明显下降，常规剂量组粥样硬化病变减轻，管腔狭窄、内膜增厚较对照组减少，强化剂量组病变明显减轻，可见钙化斑形成，且动脉较对照组柔软有弹性(见图1)，将脂质核心大于斑块40%者判定为易损斑块，D组易损斑块计数明显小于C组(P<0.05)(见表3)。

2.4MMP-9免疫组织化学改变免疫组织化学染色鉴定MMP-9表达变化(结果见图1)，常规剂量组MMP-9免疫组织化学染色强度、阳性细胞率、总积分与模型组比较明显降低(P<0.05)，强化剂量组MMP-9免疫组织化学染色强度、阳性细胞率、总积分与常规剂量组比较明显降低(P<0.05)(见表4)。

表1　4组大鼠血清hs-CRP水平比较

与对照组比较*较*P<0.05；与模型组比较△P<0.05；与常规剂量组比较#P<0.05

表2　4组颈内动脉总面积、斑块面积及斑块面积与动脉总面积的比较

与对照组比较*较*P<0.05；与模型组比较△P<0.05；与常规剂量组比较#P<0.05

表3　各组粥样硬化易损斑块数比较

与模型组组比较*P<0.01；与常规剂量组比较#P<0.05

表4　MMP-9免疫组织化学表达

与模型组组比较*P<0.01；与常规剂量组比较#P<0.05

图1A:正常组；B:模型组；C:常规剂量组；D:强化剂量组

3　讨　论

AS引起血管腔狭窄、血液循环减少导致脑供血不足及易损斑块破裂、栓子脱落引起的脑栓塞是缺血性脑卒中的主要病因。有研究表明[7，8]，在AS形成及斑块的不稳定性改变中，基质金属蛋白酶(MMPS)起到关键性作用，MMPS参与AS是的血管重构、斑块破裂、血栓形成等一系列病理生理过程，MMPS表达越高，其纤维成分大量降解，使斑块破溃形成附壁血栓机率越高，斑块越易脱落而导致脑栓塞等疾病的发生，其中MMP-9是MMPS中分子量最大的酶，有学者通过对因颈动脉粥样硬化斑块形成导致颈动脉重度狭窄的患者抽血检测，结果发现血浆MMP-9水平在诊断为易损斑块及具有临床症状的患者中明显升高[9]。国内关良劲等[10]研究发现MMP-9与颈动脉内膜中层厚度、总斑块积分、易损斑块积分呈正相关性，而和稳定斑块积分无相关性，说明血浆MMP-9水平的提高和颈动脉内膜中层增厚及斑块的不稳定性有着密切的联系。hs-CRP因其可引发炎症反应参与到AS的形成及进展过程，还可促使AS易损斑块的破裂及血栓形成，所以hs-CRP可作为AS易损斑块形成及进展的一个危险指标。

阿托伐他汀是甲基戊二酰辅酶A(HMC-COA)还原酶抑制剂通过抑制内源性胆固醇合成而降低血清胆固醇，在临床上被广泛应用于调脂，近年来，由于它的抗AS作用被发现后，越来越受到重视。日本ESTABLISH研究[11]及Wong B等[12]证实，阿托伐他汀具有逆转AS作用，它可减少AS脂纹面积及巨噬泡沫细胞大小、炎症细胞、CRP沉积，抑制泡沫细胞和平滑肌细胞产生的MMPS、稳定AS易损斑块。本研究中，B组的颈内动脉管腔明显变窄，内膜增厚，内含大量泡沫细胞及炎症细胞，光镜下可见易损斑块内新生血管增生，证明造模成功。C组和D组的血清hs-CRP及斑块中MMP-9表达均明显低于B组，这和国内相似研究得出的结果相符。本研究中，采用不同剂量阿托伐他汀干预AS大鼠颈内动脉易损斑块的形成及进展，结果发现在AS大鼠颈内动脉易损斑块计数、总斑块面积/总动脉面积、斑块内MMP-9表达等均存在明显差异(P<0.05)，提示阿托伐他汀抗AS、稳定及逆转斑块、降低脑缺血卒中的作用与其剂量呈正相关性，同时在本实验中光镜下发现易损斑块内新生毛细血管数明显增多，提示新生毛细血管的形成可能参与了易损斑块的形成及进展，但新生血管形成的机制尚不清楚，是否能通过减少斑块内新生血管的形成来抗AS，需要更加深入的研究。

[1]Daskalopoulou SS,Daskalopoulos ME,Perrea D,et al.Carotid artery atherosclerosis:What is the evidence for drug action[J].Heart,2011,97(19):1542-1546.

[2]Loftus IM,Naylor AR,Bell PR,et al.Plasma MMP-9-amarker of carotid plaque instability[J].Eurjvasc Endovasc Surg,2001,21(1):17-21.

[3]Bulman N,Levy Y,Leiba R,et al.Increased C-reactive protein levels in the polycystic orary syndrome:a marker of cardiovascular disease[J].Clin Endocrinal Metab,2004,89(11):2160.

[4]Lemaitre V,D’Armiento J.Matrix metalloproteinases in development and disease[J].Birth Defects Rosc Embryo Today,2006,78(1):1-10.

[5]Sigala F,Georgopoulos S,Papalambros E,et al.Heregulin,Cysteine rich-61 and matrix metalloproteinase-9 expression in human carotidatheroscleroticplaques:Yelationship with clinical data[J].Eurj Vasc Endovase Surg,2006,32:238-245.

[6]Wilgram GF.Dielary methed for induction of atherosclerosis coronary occlusion and myocardial infarcls inrats[J].Procsocexp Biolmed,1958,99(2):496-499.

[7]Libby P.Changing concepts of atherogenesis[J].J Intem Med,2000,247:349-358.

[8]Raffetto JD,Khalil RA.Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease[J].Biochem Pharmcol,2008,75(2):346-359.

[9]Alvaret B,Ruiz C,Chacon P,et al.Serum values of metalloproteinase-2 and metalloproteinase-9 as related to unstable plaque and inflammatory cells in patients with greater than 70% carotid artery stenosis[J].J Vasc Surg,2004,40(3):469-475.

[10]关良劲,张文,钟汉林,等.急性冠状动脉综合征患者颈内动脉斑块和血浆基质金属蛋白酶-9的关系[J].广州医学院报，2005,33:32-35.

[11]Okazaki S,Yokoyama T,Migauchi K,et al.Early statin treatment in patients with acute coronary syndrome:demonstration of the beneficial effect on atherosclerotic lesions by serial volumetric intravascular ultrasound analysis during half a year after coronary event:the ESTABLISH Study[J].Circulation,2004,110:1061-1068.

[12]Wong B,Lumman WC,Smith SM,et al.Statins suppress TGP-1 cell migration and secretion of matrix metallopoteinase-9 by inhibiting gerany lgerany lation[J].J Leukoe Biol,2001,69:959-962.

Effect of atorvastatin on atherosclerotic plaque of carotid artery and the expression of matrix metallopro-teinases-9(MMP-9) and hs-CRP in rats

GUOEnhui，LUQingshan，YANGXiaopeng，etal.

(DepartmentofNeurology，TheSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000,China)

ObjectiveTo study the inhibition effect of atorvastatin on the aortic unstable plaque area of routine atherosclerosis and the expression of MMP-9 and hs-CRP.MethodsForty eight healthy male SD rats were divided into normal group,model group,conventional-dose group and Strengthening dose group.After fourteen weeks,we measured the hs-CRP of blood,observed the pathological changes of atherosclerotic plaque under light microscope,counted the number and area of the vulnerable plaques,and observed the expression of MMP-9 through immunohistochemistry.ResultsCompared with the model group,the number and area of the vulnerable plaques,and the expression of MMP-9 of conventional-dose group and strengthening dose group were all markedly reduced(P<0.01)，the results in Strengthening dose group was less than the conventional-dose group(P<0.05),the analysis results of hs-CRP in the conventional-dose group and the strengthening dose group were less than the model group(P<0.01),the Strengthening dose group was less than the conventional-dose group(P<0.05).ConclusionThe atorvastatin can enhance plaque stability and reduce the formation and progress of the aortic plaque,restrain the expression of MMP-9 and hs-CRP,and its restrain effect has dose-effect relationship with its dose.

Atherosclerotic plaque of carotid artery;Atorvastatin;Unstable plaque;Matrix metallopro-teinase-9

1003-2754(2016)04-0307-04

2016-02-23；

2016-03-30

河南省医学科技攻关计划项目(No.201303087)

(1.郑州大学第二附属医院神经内科，河南 郑州 450000；2.首都医科大学附属北京天坛医院神经内科，北京 100000)

杨霄鹏，E-mail:yaxipe39@126.com

R743.1

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