注射用丹参多酚酸对脑缺血大鼠VEGF、IL-10的影响

白　蓉，　王　淑



注射用丹参多酚酸对脑缺血大鼠VEGF、IL-10的影响

白蓉，王淑

目的观察丹参多酚酸注射液对脑缺血大鼠VEGF、IL-10表达的影响，探讨丹参多酚酸的脑保护作用及机制。方法采用线栓法建立大鼠左侧大脑中动脉梗死模型，SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、模型组(MCAO组)、丹参多酚酸治疗组(治疗组)，按缺血时间分为4个亚组(6 h、12 h、24 h、48 h)，采用Longa法评估大鼠神经行为学，ELISA法测定血清VEGF、IL-10的含量，HE染色法观察神经元形态，免疫组化法、Western blot法检测大鼠脑组织VEGF、IL-10的表达。结果(1)Sham组神经行为学评分为0；治疗组与MCAO组相比，丹参多酚酸可以明显降低大鼠神经行为学评分(P<0.05)。(2)与Sham组相比，MCAO组与治疗组血清VEGF、IL-10含量均升高(P<0.05)，但治疗组升高更显著(P<0.05)。(3)MCAO组、治疗组缺血半暗区皮质神经元均较Sham组少，治疗组较MCAO组神经元数目明显增多；Sham组可见少量VEGF、IL-10表达，治疗组在各个时间点VEGF、IL-10的表达均较MCAO组增多(P均<0.05)。结论丹参多酚酸增强大鼠脑缺血后VEGF、IL-10的表达，可能是其保护脑细胞机制之一。

丹参多酚酸；脑缺血；血管内皮生长因子；白细胞介素-10

缺血性脑血管病具有高致残率、高死亡率、高复发率，极大危害人类健康，如何减轻缺血后的神经损伤成为临床治疗的重点。脑缺血发生后，缺血半暗区会产生大量血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等与血管新生有关的生长因子，促进血管的新生。[1]炎症反应也是脑缺血损伤的重要机制之一，白细胞介素-10(IL-10)是抗炎细胞因子，在脑缺血后发挥重要的神经保护作用[2]。丹参是经典而传统的中药材，作为治疗缺血性脑损伤药物已经广泛应用于临床。丹参多酚酸(Salvianolate)为丹参的水溶性提取物，在治疗大鼠局灶性脑缺血方面具有显著疗效，可通过降低大鼠脑组织缺血面积，细胞氧化损伤，抑制炎性细胞浸润，达到治疗急性脑缺血目的[3]。但其对大鼠脑缺血后VEGF、IL-10的表达的影响尚少见报道，本研究通过ELISA法、HE染色法、免疫组化法及Western blot方法检测VEGF、IL-10的表达情况，以阐明丹参多酚酸对脑缺血的神经保护机制。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物及分组健康雄性SD大鼠120只(体重250～280 g)，清洁级，由郑州大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(豫)2010-0002。随机分为假手术组(Sham组)、模型组(MCAO组)、丹参多酚酸治疗组(治疗组)，再按缺血时间随机分为6 h、12 h、24 h、48 h 4个亚组，每个亚组10只，5只用来做组织学染色，5只用来做Western blot蛋白检测。

1.1.2试剂及仪器注射用丹参多酚酸(天津天士力之骄药业有限公司，批准文号为国药准字Z20110011，规格为每支装0.13 g)；ECL化学发光试剂盒(康为世纪)；兔抗大鼠VEGF、IL-10抗体(Abcam公司)；山羊抗兔IgG-FITC(康为世纪)；VEGF的ELISA试剂盒(上海巧伊公司)；IL-10的ELISA试剂盒(美国 raybiotech公司)；石蜡切片机；荧光显微镜(BX50 Olympus)；Leica 显微成像系统(德国莱尔公司)；酶联免疫检测仪(美国Sat公司)；电泳仪、转膜仪(北京六一仪器厂)。

1.2方法

1.2.1动物模型建立及给药途径采用改良Longa法制备大鼠左侧大脑中动脉闭塞模型[4，5]。SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉成功后取仰卧位，颈部正中切口，依次分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈总动脉并挂线备用，结扎颈外动脉，动脉夹暂夹闭颈内动脉，在颈总动脉靠近分叉处剪一小口，将线栓插入颈内动脉，去掉动脉夹，缓慢插入至有阻力时停止进线，深度约18mm，扎紧备线，消毒，缝合，术后保温。Sham组除了不结扎血管其余步骤同模型组。大鼠清醒后治疗组腹腔注射已被0.9%氯化钠注射液稀释后的丹参多酚酸30 mg/kg，MCAO组、Sham组给予等量的生理盐水。

1.2.2神经功能学评分手术大鼠清醒后按Longa法[6]对大鼠神经行为评分，0分：无神经功能缺损；1分：不能完全伸直右侧前爪；2分：向右侧转圈；3分：向右侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。1～3分为成功造模。

1.2.3ELISA法测定脑缺血大鼠血清VEGF、IL-10含量于各时间点取大鼠上腔静脉血，4 ℃离心取上清，分别按VEGF、IL-10检测试剂盒(酶联免疫吸附实验双抗夹心法)检测，具体方法按说明书操作。

1.2.4HE染色法观察脑缺血大鼠组织学形态变化大鼠分别于缺血6 h、12 h、24 h、48 h后经多聚甲醛灌注固定后断头取脑，进行石蜡包埋，切片，厚度约5 μm，常规脱蜡水化，苏木精染色，酸化伊红乙醇复染，常规脱水、透明、中性树胶封片。显微镜下观察皮质区神经元形态。

1.2.5免疫组化法检测大鼠脑内VEGF、IL-10蛋白表达取上述石蜡切片，脱蜡修复，分别一抗、二抗孵育，DAB染色，中性树胶封片，每张图片在缺血半暗带皮质区随机选取5个不同高倍视野，计数阳性细胞数。

1.2.6Western blot检测VEGF、IL-10蛋白动物模型制备后各时间点，将大鼠麻醉后取左侧缺血区皮质脑组织，冰上进行蛋白裂解及研磨，离心取上清，BCA法测定蛋白浓度，上样、电泳，转至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉封闭，一抗孵育4 ℃过夜，二抗室温孵育2 h，在暗室曝光显影。所得图像用Image J图像处理软件分析，以目的蛋白与内参吸光度的比值即为目的蛋白相对值。

2　结　果

2.1大鼠神经行为变化Sham组神经功能缺损评分为0分；治疗组与MCAO组相比，脑缺血后6 h、12 h神经功能无明显差异(P>0.05)，24 h、48 h神经功能改善明显，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

2.2VEGF、IL-10的ELISA结果Sham组血清VEGF、IL-10含量少，MCAO组与治疗组均较Sham组高(P<0.05)，治疗组与MCAO组相比，血清VEGF、IL-10水平均升高(P<0.05)(见表2、表3)。

2.3脑缺血大鼠形态学观察Sham组大鼠脑组织结构完整，神经元细胞排列紧密，胞核染色清晰，胞质均匀(见图1A)。缺血后梗死灶周围神经元细胞变性坏死，胞核固缩，胞质不均匀(见图1B～I)。各个时间点，可以看出治疗组均较MCAO组正常的神经元细胞数目增多。

2.4VEGF、IL-10蛋白的表达情况Sham组大鼠脑组织 VEGF、IL-10仅少量表达。MCAO组、治疗组VEGF、IL-10的表达6 h时开始升高，24 h达到高峰，48 h稍有下降(见图2～图4)。各个时间点治疗组与MCAO组比较明显升高(P<0.05)(见表4～表7)。

表1　大鼠神经行为学评分[n=5，M(Q)]

用秩和检验，MCAO-SLI组与MCAO组比较*P<0.05

表2　各组大鼠血清VEGF浓度(pg/ml)的比较

与Sham组比较*P<0.05；与MCAO组比较△P<0.05

表3　各组大鼠血清IL-10浓度(pg/ml)的比较

与Sham组比较*P<0.05；与MCAO组比较△P<0.05

表4　各组大鼠VEGF阳性细胞数比较

与Sham组比较，*P<0.05；与MCAO组比较，△P<0.05

表5　各组大鼠IL-10阳性细胞数比较

与Sham组比较*P<0.05；与MCAO组比较△P<0.05

表6　各组大鼠VEGF的相对灰度值比较

与Sham组比较*P<0.05；与MCAO组比较△P<0.05

表7　各组大鼠IL-10的相对灰度值比较

与Sham组比较*P<0.05；与MCAO组比较△P<0.05

图1　各组大鼠形态学所见

图2　各组大鼠VEGF表达情况

图3　各组大鼠IL-10表达情况

1、2、3、4：Sham组6 h、12 h、24 h、48 h；5、6、7、8：MCAO组6 h、12 h、24 h、48 h；9、10、11、12：治疗组6 h、12 h、24 h、48 h

图4各组大鼠缺血脑组织VEGF、IL-10的表达

3　讨　论

VEGF最初被发现是一种血管生长和血管渗透因子，参与神经保护、抗炎过程、神经突触增生及缺血大脑重塑[7，8]。Yang等[9]采用大脑中动脉闭塞的局灶性脑缺血再灌注兔模型，在缺血2 h后颅内显微镜下注射不同剂量(低剂量：1.25 ng/μl，中剂量：2.5 ng/μl，高剂量：5.0 ng/μl)VEGF，观察兔脑梗死体积、含水量及神经功能缺损变化，发现中剂量(2.5 ng/μl)组明显降低脑梗死体积、脑组织含水量及改善神经行为功能，发挥神经保护作用，低剂量组、高剂量组脑梗死体积与生理盐水对照组无明显差异，低剂量组脑组织含水量及神经行为功能与生理盐水对照组相比无明显差异。脊髓损伤大鼠模型中在其损伤24 h后，病灶中心处注射人重组VEGF165发现IL-1β，TNF-α，IL-10的水平下调，促进大鼠神经行为功能恢复，减少运动神经元的丢失，表明VEGF可通过抑制炎症反应从而抑制脊髓损伤[10]。在VD大鼠通过外源性给予VEGF利用电生理学技术，记录大鼠海马CA1区的长时程增强(long-term potentiation，LTP)，发现VEGF明显升高VD大鼠的LTP，改善突触可塑性的降低[11]。Hayashi[12]利用cDNA序列等方法观察血管生长相关基因表达，研究了96个与血管新生相关的基因，发现42个(43.8%)，29个(30.2%)和13个(13.5%)基因分别在1 h、1 d、21 d增加，在脑缺血后24 h即出现增值的内皮细胞，3 d后血管数目增加，这意味着在脑缺血损伤后立即发生血管生成。

脑缺血损伤包括一系列复杂的病理生理过程，其中炎症反应在缺血中所引发的继发性脑损伤中起着关键作用。IL-10是由活化的单核细胞、T细胞等分泌的高活性多功能蛋白多肽分子，参与机体的免疫调节，是重要的抗炎细胞因子之一。Griui 等[13]使用IL-10基因敲除小鼠，在脑梗死24 h后，其脑梗死体积较MCAO小鼠脑梗死体积大30%；研究扩展至体外模型，与来源于野生型小鼠的神经元原代细胞相比，来源于IL-10基因敲除小鼠的神经元原代细胞对兴奋性毒性及氧-糖剥夺更敏感；结合体内及体外实验数据，表明外源性及内源性的IL- 10在脑缺血时都具有神经保护作用。

近年来，关于中药在急性脑缺血损伤的治疗方面研究非常活跃，丹参的应用尤其广泛，丹参多酚酸是丹参水溶性有机酸，可通过血脑屏障，主要通过以下几个途径改善脑缺血：(1)增加缺血区脑血流量；(2)抗血小板聚集作用，对凝血系统无影响，无出血风险；(3)抗氧化、清除自由基作用；(4)对缺氧引起的线粒体损伤有显著的保护作用；(5)参与调节细胞内钙浓度，抑制细胞凋亡[14～17]。He等[18]通过对1型糖尿病MCAO大鼠脑缺血24 h后通过尾静脉注射丹参多酚酸，每天1次并持续14 d，发现VEGF、BDNF的表达增加以及上调BDNF-TrkB-CREB信号通路，减小梗死体积，从而促进I型糖尿病MCAO大鼠脑缺血后神经功能恢复。

关于丹参多酚酸在脑缺血早期抗炎及血管保护方面的国内外研究尚少见。本实验应用丹参多酚酸作为治疗脑缺血损伤的药物，采用左侧大脑中动脉闭塞模型，选取脑缺血6 h、12 h、24 h、48 h 4个时间点从血管保护及抗炎的角度阐明其脑保护作用，结果发现脑缺血大鼠通过丹参多酚酸干预后，各个时间点治疗组血清及脑组织VEGF、IL-10表达水平明显高于MCAO组，且呈动态变化，6 h少量表达，12 h继续增高，24 h达高峰，48 h稍下降但仍处于较高水平，减少神经元凋亡数，有效的改善大鼠神经行为学功能。由此推测丹参多酚酸在缺血性脑血管病早期通过增强VEGF的表达发挥血管保护作用，通过增强IL-10的表达发挥抗炎作用，减轻脑水肿，促进神经功能恢复，为阐明丹参多酚酸治疗脑缺血提供新的理论依据和治疗思路。

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The effect of Salvianolate on expression of VEGF、IL-10 after focal cerebral ischemia injury in rats

BAIRong，WANGShu.

(DepartmentofNeurology，InstituteofClinicalMedicine，TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，China)

ObjectiveTo investigate the effect of Salvianolate on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)、IL-10 in rats with cerebral ischemia injury，and to further explore the mechanism and neuroprotection of Salvianolate. MethodsThe left middle cerebral artery occlusion(MCAO) rats models were established by Longa method. SD rats were randomly divided into three groups：sham group，MCAO group，salvianolate group. According to different ischemia time，each group was divided into 4 subtypes(6 h、12 h、24 h、48 h). The rat neurobehavioral score was evaluated by Longa’s test. The concentration of VEGF、IL-10 in serum were detected by ELISA. HE staining was used to observe the morphological structure of cortical neurons. The expressions of VEGF、IL-10 were detected by immunohistochemistry and Western blot. Results(1)The neurobehavioral score of sham group was 0.Compared with MCAO group，salvianolate could obviously reduce the behavior score in rats. (2)Compared with sham group，the concentration of VEGF、IL-10 in serum increased in MCAO group and increased obviously in salvianolate group. (3)The number of neurons in MCAO group and salvianolate group were significantly decreased than in sham group. Compared with MCAO group，the number of neurons was increased in salvianolate group. A little expression of VEGF、IL-10 could be seen on cerebral cores in sham group. The expression of VEGF、IL-10 in salvianolate group were higher than MCAO group at different time points. ConclusionSalvianolate could enhance the expression of VEGF、IL-10 after ischemia in rats. This perhaps was one of the important protective mechanisms.

Salvianolate；Middle cerebral artery occlusion(MCAO)；Vascular endothelial growth factor(VEGF)；Interleukin-10(IL-10)

1003-2754(2016)05-0411-06

2016-01-25；

2016-04-23

(郑州大学第一附属医院神经内一科，河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南 郑州 450052)

白蓉，E-mail：bai13838169212@163.com

R743.3

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