耐辐射奇球菌 DR_2327和 DR_2328基因克隆及功能分析

杨宇虹

（永州职业技术学院　永州 425100）

耐辐射奇球菌 DR_2327和 DR_2328基因克隆及功能分析

杨宇虹

（永州职业技术学院永州 425100）

通过生物信息学分析耐辐射奇球菌DR_2327和DR_2328基因及编码蛋白的基本性质，利用PCR方法克隆DR_2327和DR_2328的全基因，连接至pGEM-T载体上，转化至大肠杆菌JM109中，并进行双酶切鉴定。生物信息学分析结果表明，DR_2327和DR_2328基因位于同一操纵子中，且DR_2328蛋白具有组氨酸激酶活性，DR_2327蛋白具有反应调节子功能，提示两者很可能组成一对双组分系统。体外实验表明，DR_2327和DR_2328基因的外源表达在一定程度上提高了大肠杆菌对紫外辐照和H2O2的耐受能力。

耐辐射奇球菌，DR_2327，DR_2328，基因克隆，生物信息学分析

CLCQ78， Q527

耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans， DR）是迄今为止地球上已知生物中辐射抗性最强的物种之一，最早由美国科学家Anderson等在经X射线灭菌后仍然变质的肉罐头中分离出来［1］。进一步研究发现，DR拥有惊人的抗辐射能力，其暴露于γ射线剂量达到 5 kGy时不会丧失任何的活力，达到 15 kGy时仍然保持37%的细胞活力，在由137Cs源提供的剂量率高达60 Gy/h的持续γ辐照条件下仍能维持生长且不会诱发突变，在接受由10 MeV，18 kW的β射线源提供的15 kGy辐照后，培养12 h的细胞活力达到对照条件下的50%左右［2-5］。然而接受电离辐射达到 5～6 Gy时便能引起一个健康成年人的死亡，达到200～800 Gy时能灭活大肠杆菌等常见微生物。接受这种高剂量的电离辐射会导致DR的基因组破碎成无以数计的DNA片段，但这些DNA碎片在DR的下一次细胞分裂前能得到有效的修复，重新精确组装成完整的基因组而不会发生突变。

DR在极端辐射环境下表现出来的超强DNA损伤修复能力表明其拥有一套高效、精确的DNA损伤修复系统，而在这个修复系统中首先要能快速的感受到外界环境的变化，从而快速启动机体的应对机制。双组分系统 （Two-component regulatory system， TCS） 是细菌感受外界环境变化并启动内部应激反应的重要组成部分，由组氨酸激酶（Histidine kinase， HK）和反应调节器（Response regulator， RR）两个基本元件构成，对细菌适应不良环境条件起着关键作用［6-7］。在 DR中，Desai等［8］发现 DR_B0090和DR_B0091组成一对双组分系统，DR_B0090和DR_B0091的单或双敲除株表现出对 DNA损伤剂的敏感性增强，且 DNA双链断裂修复明显延迟，这表明双组分系统对DR的DNA损伤修复能力具有重要作用，也提示DR中还存在由其它基因组成的双组分系统。

本研究利用生物信息学的方法预测DR中可能的双组分系统，初步证明蛋白DR_2327和DR_2328很可能在DR中组成一对双组分系统，目前国内外尚未见针对DR_2327和DR_2328基因功能研究的报道，其在 DR中的具体功能未知。本研究对DR_2327和DR_2328的基本性质和功能进行分析和预测，利用PCR的方法克隆这两个基因并保存在T载体中，为进一步研究 DR的双组分系统及DR_2327、DR_2328的生物学功能提供实验基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

Deinococcus radiodurans R1（编号 CGMCC 1.633）购自中国科学院微生物所菌种保藏中心，E.coli JM109菌株由中心实验室保存，pGEM-T Easy Vector 购自 Promega 公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；限制性内切酶 EcoR I、Xho I、T4 DNA 连接酶购自Fermentas 公司；琼脂糖、胰蛋白胨酵母提取物、葡萄糖、NaCl购自 OXID公司；DNA Maker购自康为世纪生物技术有限公司，引物合成委托上海生工完成。

1.2主要仪器

DTC-3 PCR 基因扩增仪（上海嘉鹏），HPX-9052MBE电热恒温培养箱（上海博迅），SHZ-A水浴恒温振荡器（上海博迅），DYCP-31CN琼脂糖水平电泳仪（北京六一），WD-9413A型凝胶成像分析系统（北京六一），FA2004B型电子天平（上海越平）。

1.3方法

1.3.1DR_2327和DR_2328的生物信息学分析

在GenBank数据库中获取DR_2327和DR_2328的基因组和蛋白质序列，并分析 DR_2327和DR_2328基因在 DR基因组中的定位，利用Genome2D 在线数据库分析DR_2327和DR_2328是否位于同一个操纵子中，利用 SSDB预测DR_2327和DR_2328蛋白的结构域，利用NPS在线服务器和 SWISS-MODEL对 DR_2327和DR_2328基因编码的蛋白质进行同源建模分析。

1.3.2引物设计

根据在GenBank数据库中获取的DR_2327和DR_2328的基因序列，利用Primer Premier 6.0 软件设计 PCR扩增引物，在两端加上合适的酶切位点和保护碱基， 扩增DR_2327的上游引物DR_2327-F序列为：5'-CGGAATTCATGCGCCTGCTGCTCG TCGA-3'（下划线为EcoR I酶切位点），下游引物DR_2327-R序列为：5'-TCCTCGAGTCACT TCTCG GTCCG GTAGCCC-3'（下划线为Xho I酶切位点）；扩增DR_2328的上游引物DR_2328-F序列为：5'-CG GAATTCGTGAAGCTCTCGCTGCGTG-3'（下划线为EcoR I酶切位点），下游引物DR_2328-R序列为：5'-TCCTCGAGTCATGGCGTCACATGCTCCGGT-3'（下划线为Xho I酶切位点）。委托上海生工合成上述引物。

1.3.3DR基因组的提取

从-80 ℃超低温冰箱中取出保存的DR菌种，接种于营养肉汁琼脂固体培养基（蛋白胨10 g/L，牛肉提取物3 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂15 g/L）中，30 ℃倒置培养36 h，挑取单克隆转接于TGY液体培养基（蛋白胨5 g/L，酵母提取物3 g/L，葡萄糖1 g/L），30 ℃，215 r/min振荡培养48 h，离心收集菌体，采用CTAB/NaCl法提取DR全基因组DNA。

1.3.4DR_2327和DR_2328的克隆

采用PCR方法从提取的DR基因组DNA中扩增出目的基因 DR_2327和 DR_2328，反应程序为94 ℃预变性5 min，（94 ℃变性1 min，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环），72 ℃延伸 5 min，产物用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测目的基因并进行胶回收。回收产物和pEGM-T载体分别用Xho I和EcoR I进行双酶切，4 ℃连接过夜，连接后的产物转化大肠杆菌JM109 感受态中，接种在LB固体平板（蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂15 g/L）上，37 ℃倒置培养过夜。蓝白斑筛选法获取阳性克隆，培养后提取质粒，用Xho I和EcoR I双酶切鉴定。

1.3.5紫外辐照处理

将转染pEGM-T空载体、pEGM-DR_2327和pEGM-DR_2328的大肠杆菌JM109培养至OD600值约1.2，用新鲜的培养基梯度稀释106倍，取100 μL菌液均匀涂抹至LB平板中，用强度800 W/m2波长254 nm的紫外灯分别照射2、4、6、8、10、12 s，各吸收剂量做重复3次测定。37 ℃恒温培养箱内倒置培养过夜，取出平板计数菌落，计算存活率。

1.3.6过氧化氢处理

将转染pEGM-T空载体、pEGM-DR_2327和pEGM-DR_2328的大肠杆菌JM109培养至对数生长期，取H2O2母液分别配制10、20、30、40、50 mmol/L的溶液分别加入到100 μL菌液中，混匀后4 ℃遮光处理30 min，加入100 μg/mL的过氧化氢酶处理剩余的H2O220 min。稀释菌液至合适浓度后分别涂板，37 ℃倒置培养过夜，观察平板上菌落数目并计算存活率。H2O2处理组均重复3次测定取均值。

2　结果与分析

2.1DR_2327与DR_2328在基因组上的定位

从NCBI数据库获取DR_2327与DR_2328的基因序列，其中DR_2327的基因序列长为663 bp，编码蛋白质含220个氨基酸残基；DR_2328的基因序列长为1 509 bp，编码的蛋白质包含502个氨基酸残基。DR_2327与DR_2328均位于DR基因组的染色体I中，为相邻基因，具体位置如图1所示。为了进一步研究两者的位置关系，利用Genome2D 在线软件对 DR的全基因组进行分析，结果显示DR_2327、DR_2328与上游的DR_2326三个基因位于同一个操纵子中。

2.2DR_2327与 DR_2328编码蛋白质结构与功能预测

2.2.1DR_2327与 DR_2328蛋白质二级结构预测

利用 NPS服务器中的 SOPMA算法预测DR_2327与DR_2328编码蛋白质的二级结构［9］，结果显示 DR_2327编码的蛋白二级结构主要为α螺旋，无规则卷曲次之，β片层第三，转角最少（图2），而 DR_2328编码的蛋白二级结构主要为α螺旋，β片层次之，无规则卷曲最少（图3）。

2.2.2DR_2327与 DR_2328蛋白质三级结构预测

为进一步了解DR_2327与DR_2328蛋白质的高级结构，采用 SWISS-MODEL在线软件对DR_2327和DR_2328基因编码的蛋白质进行同源建模，结果见图4。由图4可知，DR_2327蛋白质的三级结构主要由螺旋和卷曲组成，与二级结构组成基本一致，整体上与假定的组氨酸激酶CovS和传感蛋白CPXA具有较高的相似性，末端还具有螺旋-转角-螺旋结构，提示其可能具有DNA结合功能。

DR_2328蛋白质的三级结构主要由螺旋和片层组成，与二级结构组成基本一致，末端存在片层连接两个α螺旋的HAMP样结构域（图4），这与组氨酸激酶的受体、ATP水解酶等结构上具有较高的相似性。蛋白质三级结构提示DR_2327与DR_2328蛋白质具有组成细菌双组分系统蛋白的特性。

2.2.3DR_2327与DR_2328的功能结构分析

为了进一步分析DR_2327和DR_2328的功能结构域，利用 NCBI数据库中的 Conserved Domains［10］在线工具对DR_2327和DR_2328蛋白的功能结构域进行分析，结果表明DR_2327蛋白主要具有REC、Trans_reg_C和OmpR等功能结构域，包含8个激活位点、9个DNA结合位点、1个磷酸化位点、多个二聚化接口（图5，表1）。REC是信号接受结构域，在细菌中广泛存在，如CheY、OmpR、 NtrC和PhoB等，包含一个磷酸化受体位点，能接收传感蛋白的信号，在细菌的信号转导过程中起重要作用。Trans_reg_C是反应调节子效应结构域，在细菌和真核生物的双组分系统中高度保守，DR_2327蛋白的Trans_reg_C结构域包含DNA结合位点，提示其是一种 DNA结合反应调节子，与OmpR调节子高度相似。DR_2328蛋白主要包含HAMP、HisKA、HATPase_c、Trans_reg_C等结构域，具有1个磷酸化位点，13个ATP结合位点，1个Mg2+离子结合位点，4个G-x-G基序，多个二聚化接口（图6，表2）。HAMP即组氨酸激酶（Histidine kinases）、腺苷酸环化酶（Adenylate cyclases）、甲基受体蛋白（Methyl accepting proteins）和磷酸酶（Phosphatases）结构域，是一段50个氨基酸残基的由α螺旋区域，一般以二聚体形式存在，在多种信号转导途径中起重要作用。HisKA结构域一般以二聚体形式存在，形成4螺旋结构，拥有保守的组氨酸残基，可以通过反式自磷酸化激活，转移磷酰基给天冬氨酸残基，发挥信号转导功能，在细菌双组分系统中广泛存在。HATPase_c即组氨酸激酶样ATP酶，该家族主要包括多个ATP结合蛋白，如组氨酸激酶、DNA促旋酶 B、拓扑异构酶，热休克蛋白HSP90、光敏色素类ATP酶和DNA错配修复蛋白等，具有重要的生物学功能。

表1　DR_2327蛋白的保守结构域分析Table 1　Conserved domains analysis result of DR_2327

表2　DR_2328蛋白的保守结构域分析Table 2　Conserved domains analysis result of DR_2328

2.3DR_2327与DR_2328的基因克隆

以DR基因组DNA为模板，利用设计的特定引物进行PCR扩增，克隆DR_2327与DR_2328基因，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对应泳道可见分别为663 bp和1509 bp的条带（图7（a）），与目的基因大小一致；将PCR产物回收、纯化、酶切后与pEGM-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM 109，过夜培养后提取重组质粒，经Xho I和EcoR I双酶切鉴定，对应泳道分别得到663 bp和3 015 bp、1 509 bp和3 015 bp条带（图7（b）），表明成功克隆DR_2327和DR_2328基因。

2.4DR_2327与DR_2328基因的表达对大肠杆菌UV辐照压力存活率的影响

为了确定 DR_2327与DR_2328基因的表达对大肠杆菌紫外辐照耐受的影响，我们对转染pEGM-DR_2327、pEGM-DR_2328载体的JM109进行了不同剂量的紫外辐照处理，并与转染pEGM-T空载体组比较，观察它们细胞存活率的变化情况。实验结果表明，与空载体组相比，pEGM-DR_2327和 pEGM-DR_2328转染组的紫外辐射抗性显著增强（见图 8）。由图 8可知，当紫外辐照 2 s时，pEGM-DR_2327转染组的生存率在 40%以上，pEGM-DR_2328的生存率在50%以上，而对照的空载体转染组仅20%左右；照射6 s时，对照组已存在明显的致死性效应，存活率不足 1%，而此时pEGM-DR_2327转染组的存活率仍有 15%左右，pEGM-DR_2328转染组的存活率仍有 30%左右。pEGM-DR_2327和pEGM-DR_2328转染组在紫外辐照下表现出较强的抗性，提示 DR_2327和DR_2328基因在紫外辐射抗性方面发挥重要作用，且DR_2328基因的抗性能力更强，但其具体机制还有待进一步研究。

2.5DR_2327与DR_2328基因的表达对大肠杆菌H2O2压力存活率的影响

氧化应激是电离辐射对生物大分子产生损伤的重要机制。为了确定 DR_2327与DR_2328基因的表达能否增强大肠杆菌的抗氧化能力，我们对转染pEGM-DR_2327、pEGM-DR_2328载体的JM109用不同浓度的H2O2处理，并与转染pEGM-T空载体组比较，观察它们细胞存活率的变化情况。如图 9所示，在稳定生长期，10 mmol/L H2O2处理30 min后，各处理组的存活率均显著下降，空载体组、pEGM-DR_2327组和pEGM-DR_2328组的存活率分别约为45%、47%和55%；20 mmol/L H2O2条件下，两者的下降趋势都较快，空载体组、pEGM-DR_2327组和pEGM-DR_2328组的存活率分别约为23%、28%和36%；30 mmol/L浓度H2O2处理后，空载体组的生存率降至不到 10%，pEGM-DR_2327组和pEGM-DR_2328组的生存率约为12%和17%；高浓度H2O2（＞30 mmol/L）下空载体组几乎不能生长，而 pEGM-DR_2327组和pEGM-DR_2328组的存活率仍在8%左右的。实验结果显示，DR_2327和DR_2328基因的外源表达均能够在一定程度上增强E.coli细胞的抗氧化能力。

3　讨论

随着核电及核技术的不断发展，核能在人类社会的应用越来越广泛，核安全与核防护日渐成为人们关注的热点，寻找应对核威胁的有效方法是多个政府部门和一大批科技工作者的工作重心。耐辐射奇球菌拥有极端的辐射抗性，自发现以来吸引了众多学者探索其辐射抗性机制，并对其能否应用于其他领域进行了初步探索，结果表明DR的特有基因在处理核工业废料［11］和增强其他生物的抗逆境能力等方面展现出了较好的潜力［12-15］。进一步解读DR的辐射抗性机制和探索其基因功能具有重要的研究价值和应用意义。DR极端的辐射抗性机制得益于其拥有一套高效、精确的DNA损伤修复系统，可以准确无误的快速修复辐射等因素造成的DNA损伤，而这需要能快速的感受到外界环境的变化并启动机体的应对机制。TCS是细菌应对环境压力的重要信号转导系统，DR中包含多对可能的TCS，对其极端辐射抗性很可能具有极其重要的作用。本研究中我们通过生物信息学的方法对 DR_2327与DR_2328进行了系统的分析，发现两者位于同一操纵子中，且DR_2327编码产物具有典型的组氨酸激酶反应调节子特性，DR_2328编码产物具有典型的组氨酸激酶活性，提示两者很可能组成DR的一对双组分系统，并克隆了DR_2327和DR_2328基因，初步证明外源表达DR_2327或DR_2328均能在一定程度上增强大肠杆菌JM109对紫外辐照和氧化损伤的耐受能力，且DR_2328的效果可能更强些，提示两者对DR的辐射抗性具有一定的作用。如能将DR_2327和DR_2328同时共转染到细菌中，能更好的发挥双组分功能，可能对不良环境的抗逆性更强些。当然对DR_2327和DR_2328具体作用的解读还需要进一步进行功能研究来证实。

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Cloning， and functional analysis of DR_2327 and DR_2328 in Deinococcus radiodurans

YANG Yuhong
（Yongzhou Vocational Technical College， Yongzhou 425100， China）

The main characteristics of DR_2327and DR_2328 in Deinococcus radiodurans were analyzeed by bioinformatics. Full-length gene of DR_2327 and DR_2328 was amplified by PCR， and constructed in pGEM-T vector. Transformed recombinant vector into E.coli JM109 and followed by restriction enzyme digestion. DR_2327 and DR_2328 gene was cloned successfully. Bioinformatic analysis results showed that DR_2327 and DR_2328 gene located in the same operon， and DR_2328 protein with histidine kinase activity， DR_2327 protein with response regulator activity. It is suggested that DR_2327 and DR_2328 constitute a two-component system in Deinococcus radiodurans. In vitro experiments showed that DR_2327 and DR_2328 could enhance tolerance to UV radiation and H2O2of E.coli.

Deinococcus radiodurans， DR_2327， DR_2328， Gene cloning， Bioinformatics analysis

YANG Yuhong （female） was born in October 1984 and obtained a master degree from University of South China in 2015，Lecturer， E-mail： yyh_100@163.com.

6 June 2016； accepted 7 July 2016

Q78，Q527

10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.050203

杨宇虹，女，1984年10月出生，2015年于南华大学获理学硕士学位，讲师，E-mail： yyh_100@163.com

初稿2016-06-06，修回2016-07-07