人工合成抗菌肽对口腔细菌抗菌性能的临床研究

刘晓丹

人工合成抗菌肽对口腔细菌抗菌性能的临床研究

刘晓丹

目的 探讨人工合成抗菌肽对口腔细菌的抗菌性能。方法 选取9种人工合成抗菌肽（Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb）和6种口腔细菌（白色念珠菌、具核梭杆菌、嗜酸乳杆菌、变异链球菌、唾液链球菌、血液链球菌）做体外实验，分析人工合成抗菌肽对口腔细菌的抗菌性能。结果 chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa对白色念珠菌具有高抑菌率；Brevinin、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb对具核梭杆菌、变异链球菌、唾液链球菌、血液链球菌具有高抑菌率；Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb对嗜酸乳杆菌具有高抑菌率；Brevinin最小抑菌浓度：血液链球菌＞具核梭杆菌＞唾液链球菌＞变异链球菌＞嗜酸乳杆菌；chensinin-1最小抑菌浓度：嗜酸乳杆菌；chensinin-1b最小抑菌浓度：嗜酸乳杆菌＞唾液链球菌＞血液链球菌＞具核梭杆菌＞白色念珠菌＞变异链球菌；L-K5V1最小抑菌浓度：嗜酸乳杆菌＞具核梭杆菌＞变异链球菌＞白色念珠菌＞唾液链球菌＞血液链球菌；L-K6最小抑菌浓度：唾液链球菌＞血液链球菌＞白色念珠菌＞变异链球菌＞具核梭杆菌＞嗜酸乳杆菌；L-K6V1最小抑菌浓度：嗜酸乳杆菌＞血液链球菌＞唾液链球菌＞白色念珠菌＞具核梭杆菌＞变异链球菌；L-K6V2最小抑菌浓度：白色念珠菌＞变异链球菌＞唾液链球菌＞嗜酸乳杆菌＞具核梭杆菌＞血液链球菌；Temporin-1CEa最小抑菌浓度：白色念珠菌＞具核梭杆菌＞唾液链球菌＞嗜酸乳杆菌＞变异链球菌＞血液链球菌；Temporin-1CEb最小抑菌浓度：唾液链球菌＞具核梭杆菌＞变异链球菌＞血液链球菌＞嗜酸乳杆菌。结论 不同人工合成抗菌肽对口腔细菌的抗菌性能不同，Temporin-1CEa的最小抑菌浓度较小，且抑菌效果佳。

人工合成抗菌肽；口腔细菌；抗菌性能

由于抗生素的大量使用，导致很多致病菌和真菌菌株产生了不同程度的耐药性［1-2］，所以临床亟待寻求更为有效的抗菌药物。抗菌肽是生物体内广泛存在的一种抵抗外来微生物入侵和体内突变细胞而产生的多肽，具有广谱抗菌活性［3-4］。抗菌肽具有分子小、水溶性好、稳定性高等特点。由于多数抗菌肽带正电荷，能与带负电荷的细菌细胞膜通过静电吸引相结合，可通过特有的两亲性结构插入细菌细胞膜而形成孔洞，使细菌难以对抗抗菌肽而产生抗药性。抗菌肽不仅对细胞有良好活性，对真菌也有较强的杀伤作用。近年来研究发现，人工合成抗菌肽与天然产生的抗菌肽相比，具有更高抗菌活性，可应用于临床。但不同的人工合成抗菌肽具有的抗菌性能是不同的。因而我院开展了此研究，选取9种人工合成抗菌肽（Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb）和6种口腔细菌（白色念珠菌、具核梭杆菌、嗜酸乳杆菌、变异链球菌、唾液链球菌、血液链球菌）做体外实验，分析人工合成抗菌肽对口腔细菌的抗菌性能，现报道如下。

1 仪器试剂与方法

1.1药品与试剂 菌株：白色念珠菌、具核梭杆菌、嗜酸乳杆菌、变异链球菌、唾液链球菌、血液链球菌，人工合成抗菌肽：包括Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb，均购自于上海吉尔生化有限公司；牛肉膏蛋白胨液体培养基、水等。1.2 仪器 标准96孔微量板（Sigma公司）；超净工作台SW-CJ-2FD（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；台式恒温振荡器THZ-C（海门市麒麟医用仪器厂）；分析天平CP224S（Olympus）；显微镜CX21FS1（Olympus）；酶标仪（Thermo）；数昱立式压力蒸气灭菌锅YXO-LS-30SⅡ（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；烘箱WK891（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.3方法 人工合成抗菌肽的筛选原则为100 μm人工合成抗菌肽与105 CFU/ml菌液作用，抑菌率达90%以上，行最小抑菌浓度检测。操作如下：通过接种环，将菌株从斜面培养基上取下，转入10 mlLB液体培养基中，在恒温振荡培养箱中37 ℃过夜，使菌株处于对数生长期。用血球计数板进行计数，用LB液体培养基稀释至2倍。将人工合成抗菌肽分别用无菌水溶解。实施分组，实验组为抗菌肽+菌株，对照组为菌株+水、水+LB培养基、LB培养基+抗菌肽。恒温箱中培养过夜，600 nm下测量吸光值。抑菌率（%）=1-［（抗菌肽+菌株组）吸光值-（LB培养基+抗菌肽组）吸光值］/［（菌株+水组）吸光值-（水+LB培养基组）吸光值］×100%。抑菌率达90%以上时，人工合成抗菌肽的浓度为最小抑菌浓度。

2 结果

2.1人工合成抗菌肽对口腔细菌抑制情况分析 chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa对白色念珠菌具有较高抑菌率；Brevinin、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb对具核梭杆菌、变异链球菌、唾液链球菌、血液链球菌具有较高抑菌率；Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、 Temporin-1CEb对嗜酸乳杆菌具有高抑菌率。见表1。

表1　人工合成抗菌肽对口腔细菌抑制情况分析（%）

2.2人工合成抗菌肽对口腔细菌的最小抑菌浓度分析 Brevinin最小抑菌浓度：血液链球菌＞具核梭杆菌＞唾液链球菌＞变异链球菌＞嗜酸乳杆菌；chensinin-1最小抑菌浓度：嗜酸乳杆菌；chensinin-1b最小抑菌浓度：嗜酸乳杆菌＞唾液链球菌＞血液链球菌＞具核梭杆菌＞白色念珠菌＞变异链球菌；L-K5V1最小抑菌浓度：嗜酸乳杆菌＞具核梭杆菌＞变异链球菌＞白色念珠菌＞唾液链球菌＞血液链球菌；L-K6最小抑菌浓度：唾液链球菌＞血液链球菌＞白色念珠菌＞变异链球菌＞具核梭杆菌＞嗜酸乳杆菌；L-K6V1最小抑菌浓度：嗜酸乳杆菌＞血液链球菌＞唾液链球菌＞白色念珠菌＞具核梭杆菌＞变异链球菌；L-K6V2最小抑菌浓度：白色念珠菌＞变异链球菌＞唾液链球菌＞嗜酸乳杆菌＞具核梭杆菌＞血液链球菌；Temporin-1CEa最小抑菌浓度：白色念珠菌＞具核梭杆菌＞唾液链球菌＞嗜酸乳杆菌＞变异链球菌＞血液链球菌；Temporin-1CEb最小抑菌浓度：唾液链球菌＞具核梭杆菌＞变异链球菌＞血液链球菌＞嗜酸乳杆菌。见表2。

表2　人工合成抗菌肽对口腔细菌的最小抑菌浓度分析（μ mol/L）

3 讨论

目前，较为常见的口腔细菌有白色念珠菌、具核梭杆菌、嗜酸乳杆菌、变异链球菌、唾液链球菌、血液链球菌。白色念珠菌是一种真菌，通常存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不会引起疾病，当机体免疫功能或一般防御能力下降时，或正常菌群相互制约作用失调时，白色念珠菌大量繁殖并改变生长形式（芽生菌丝相）侵入细胞引起疾病。具核梭杆菌是一种革兰阴性口腔共生菌，但它有潜力致病，有时会引起牙周病，在口腔乃至全身感染性疾病中检出率极高，有研究显示［5-6］，大肠癌患者相关组织中存在大量具核梭杆菌，显示两者之间可能存在某种关联。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属，不仅存在于口腔中，还存在于胃及小肠中，是人体的主要益生菌之一。有研究显示，嗜酸乳杆菌对口腔白色念珠菌有明显的抑制作用［7］。变异链球菌是主要导致口腔龋齿的细菌之一，常见于牙菌斑中，可通过代谢产生的酸性物质导致龋齿的发生。唾液链球菌属于口腔正常菌群，与健康者相比，口臭者口腔中唾液链球菌数量较少。有研究表明［8-9］，唾液链球菌可以产生某种细菌素，对口臭相关细菌有抑制作用。血液链球菌是口腔正常菌群之一，随着牙齿的萌生早期定植牙面，通过植物血凝素样附着素，非植物血凝素样附着素与唾液中受体特异结合，粘附于获得性膜上，以疏水作用维持其稳定，可与多种细菌发生聚集反应，在龈上，龈下菌斑形成中起重要作用，血液链球菌通过产生过氧化氢和血链素拮抗牙周病的可疑致病菌，是牙周主要有益菌。

诸多研究显示［10-11］，抗菌肽在口腔科中的应用较常见，在抑制和杀死微生物抗菌活性的同时，还可以对细菌生物被膜的形成过程有一定作用，对机体免疫系统有一定调节作用。尤其是炎性反应，抗菌肽可以对炎性因子的释放实施调控，进而控制炎性反应。目前，抗菌肽已成为生物保健、医药卫生、食品化工等多个领域的研究热点。人工合成抗菌肽在临床中的应用具有诸多优势［12-13］。

此次研究选用了Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb，对口腔细菌抗菌性能进行了分析。本研究结果显示，9种人工合成抗菌肽对6种口腔细菌的抗菌性能是不同的。由人工合成抗菌肽对口腔细菌的最小抑菌浓度分析，Temporin-1CEa的最小抑菌浓度较小，且抑菌效果佳，具有较高临床应用价值。以Temporin-1CEa为例进行分析，抗菌肽对炎性反应具有明显的抑制作用。炎症是机体对抗外界造成的伤害和感染的第一个步骤，是一个复杂程序，生物机体会释放炎性因子和介质，将其运输到感染部位，用于消除感染因子，而过度炎症是有害的。抗菌肽发挥着免疫调节的功能，免疫在针对感染和炎症的威胁时发挥着重要作用，而抗菌肽是宿主免疫系统的重要组成部分。抗菌肽还具有趋化活性，能够充当吞噬细胞及单核细胞的趋化因子，有效刺激单核细胞与中性粒细胞趋化因子的生成，在炎性反应的发生部位聚集，帮助解除炎症威胁。

综上所述，不同人工合成抗菌肽对口腔细菌的抗菌性能不同，Temporin-1CEa的最小抑菌浓度较小，且抑菌效果佳。

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Clinical Research of Synthetic Antibacterial Peptide in Antibacterial Properties of Oral Bacteria

Liu Xiaodan

Objective To investigate synthetic antibacterial peptide in antibacterial properties of oral bacteria.Methods 9 kinds of synthetic antibacterial peptide（Brevinin，chensinin-1，chensinin-1b，L-K5V1，L-K6，L-K6V1，L-K6V2 and temporin lcea，Temporin-1CEb）and 6 kinds of oral bacteria（Candida albicans，Fusobacterium nucleatum，Lactobacillus acidophilus，Streptococcus mutans，Streptococcus salivarius，Streptococcus sanguinis）were used to vitro experiment.Synthetic antibacterial peptide in antibacterial properties of oral bacteria was analyzed.Results Chensinin-1b，L-K5V1，L-K6，L-K6V1，L-K6V2，Temporin-1CEa had high inhibitory rate with Candida albicans.Brevinin，chensinin-1b，L-K5V1，L-K6，L-K6V1，L-K6V2，Temporin-1CEa，Temporin-1CEb had high inhibitory rate with Fusobacterium nucleatum，Streptococcus mutans，Streptococcus salivarius，Streptococcus sanguinis.Brevinin，chensinin-1，chensinin-1b，L-K5V1，L-K6，L-K6V1，L-K6V2，Temporin-1CEa，Temporin-1CEb had high inhibitory rate with Lactobacillus acidophilus. Minimum inhibitory concentrations of Brevinin:Streptococcus sanguinis＞Fusobacterium nucleatum＞Streptococcus salivarius＞Streptococcus mutans＞Lactobacillus acidophilus.Minimum inhibitory concentrations of chensinin-1: Lactobacillus acidophilus.Minimum inhibitory concentrations of chensinin-1b:Lactobacillus acidophilus＞Streptococcus salivarius＞Streptococcus sanguinis＞Fusobacterium nucleatum＞Candida albicans＞Streptococcus mutans. Minimum inhibitory concentrations of L-K5V1:Lactobacillus acidophilus＞Fusobacterium nucleatum＞Streptococcus mutans＞Candida albicans＞Streptococcus salivarius＞Streptococcus sanguinis.Minimum inhibitory concentrations of L-K6:Streptococcus salivarius＞Streptococcus sanguinis＞Candida albicans＞Streptococcus mutans＞Fusobacterium nucleatum>Lactobacillus acidophilus.Minimum inhibitory concentrations of L-K6V1:Lactobacillus acidophilus＞Streptococcus sanguinis＞Streptococcus salivarius＞Candida albicans＞Fusobacterium nucleatum＞Streptococcus mutans.Minimum inhibitory concentrations of L-K6V2:Candida albicans＞Streptococcus mutans＞Streptococcus salivarius＞Lactobacillus acidophilus＞Fusobacterium nucleatum＞Streptococcus sanguinis.Minimum inhibitory concentrations of Temporin-1CEa:Candida albicans＞Fusobacterium nucleatum＞Streptococcus salivarius＞Lactobacillus acidophilus＞Streptococcus mutans＞Streptococcus sanguinis.Minimum inhibitory concentrations of Temporin-1CEb:Streptococcus salivarius＞Fusobacterium nucleatum＞Streptococcus mutans＞Streptococcus sanguinis＞Lactobacillus acidophilus.Conclusion Different synthetic antimicrobial peptides on the antibacterial performance of oral bacteria is different，the minimum inhibitory concentration of Temporin-1CEa is small，and the inhibitory effect is good.

Synthetic antibacterial peptide；Oral bacteria；Antibacterial property

R781.5

A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.10.037

辽宁省本溪市中心医院，辽宁本溪 117000