TNF-α基因的多态性与肺炎支原体肺炎的相关性分析

陈　洁　宋立强⋆

TNF-α基因的多态性与肺炎支原体肺炎的相关性分析

陈洁宋立强⋆

目的 探讨人肿瘤坏死因子（TNF）-α-308位点的多态性，为人肺炎支原体肺炎疾病的预防及治疗提供理论基础。方法 选取肺炎支原体肺炎患者92例为观察组，同期选择与观察组年龄匹配，无血缘关系的92例健康志愿者为对照组。采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）检测TNF-α基因的多态性；分析两组各个基因型的实际值和期望值，及各基因型和等位基因的分布频率；利用DNA测序对两组TNF-α-308位点的多态性与人肺炎支原体肺炎易感性之间的关系进行分析；ELISA检测两组患者血清TNF-α蛋白浓度。结果 TNF-α-308位点存在野生型（GG），杂合型（GA）和突变型（AA）三种基因型，两组均以GG型为主，两组各基因型的频率间差异均有统计学意义（P＜0.05）。此外，研究还发现两组间等位基因A和G分布差异均有统计学意义（P＜0.05），且等位基因A与肺炎支原体肺炎易感性具有显著的相关性（P＜0.05）；ELISA结果显示观察组血清TNF-α蛋白浓度高于对照组健康人群。在观察组AA基因型的TNF-α蛋白的蛋白浓度显著高于GG型（P＜0.05）。结论 人肿瘤坏死因子（TNF）-α-308位点的多态性与人肺炎支原体肺炎易感性具有一定的相关性。

肿瘤坏死因子-α 多态性 肺炎支原体肺炎 基因分型

支原体肺炎是肺炎支原体引起的急性呼吸道感染肺炎。该疾病一般起病缓和，但病程长，常引起多系统肺外的并发症，导致支气管炎及支气管扩张等疾病。肿瘤坏死因子（TNF）是体内具有多种生物活性的内源性细胞因子。研究表明，TNF-α在肺炎支原体肺炎患者体内含量显著增高［1］，可刺激气道平滑肌细胞分泌内皮素-1，使气道平滑肌收缩，气道细胞增殖，引起气道重构［2］，促进支气管上皮细胞及肺泡巨噬细胞产生IL-6和IL-8［3］。但TNF-α在支原体肺炎中的具体作用机制还不完善。本文探讨TNF-α基因-308位点多态性与肺炎支原体肺炎的关系，为该疾病的深入研究提供理论基础。

1　临床资料

1.1一般资料 2010年8月至2014年12月本院收治肺炎支原体肺炎患者92例为观察组，同期选择92例与观察组年龄匹配，无血缘关系的健康志愿者为对照组。肺炎支原体肺炎患者的诊断标准参照《儿科学》第六版。所有研究对象均自愿签署知情同意书。两组性别及年龄差异均无统计学意义。

1.2血清中TNF-α蛋白浓度的测定 空腹抽取静脉血2ml，采用武汉博士德生物公司的试剂盒，用酶联吸附实验（ELISA）严格按照说明书进行血清中TNF-α蛋白水平的测定。

1.3DNA的提取和PCR扩增 采用酚-仿法提取血液中的DNA。根据Genbank基因序列rsl800629设计TNF-α引物序列，上游引物为5'-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3'；下游引物为，5'-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3'，引物由宝生物工程公司合成。RT-PCR总反应体系为50μl（2.5μl dNTP，上下游引物各1μl，5μl 10×Taqbuffer，0.3μl E-Taq，1.5μl PCR产物，ddH2O 39.4μl）。反应条件为预变性95℃ 5min，30个循环的变性95℃，30s；退火55℃，45s；延伸72℃，1min，最后一个循环的72℃，5min的延伸。PCR产物通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4RFLP基因分型 用Ncol内切酶来对PCR扩增产物切割，然后通过琼脂糖凝胶电泳来完成RFLP分型。反应体系：PCR产物25μl，内切酶1μl，缓冲液3μl，ddH2O 1μl。37℃酶切12h。取15μl酶切产物通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。根据RFLP的分析结果，用切胶回收试剂盒回收不同基因型的扩增片段，纯化后连接到pMD19-T载体上，转化到DH5α，提取质粒鉴定后测序。

1.5统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件。数据以（x±s）表示。Hardy-Weinberg 平衡检验进行群体代表性分析。优势比（OR）及Miettinen方法计算的95%可信区间来检测TNF-α基因-308位点的多态性与肺炎支原体肺炎的相关性［4］。通过Bonferroni t检验方法统计基因型与TNF-α间的关系［5］。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1PCR-RFLP基因分型 PCR产物经检验特异性扩增良好，无非特异行扩增，片段大小与实际相符，可进行RFLP分析。对PCR产物进行Ncol内切酶酶切的RFLP分析，经琼脂糖电泳检测发现TNF-α存在多态性，共得到3种基因型GG、GA和AA（图1a）。其中单一条带的为两种纯合基因型，两条带为杂合型。将两种纯合型个体进行基因测序并通过Genbank进行BLAST比对发现，在TNF-α-308处存在多态性，其中GG为野生型，GA为杂合基因型，AA为突变型（见图1b、c）

2.2Hardy-Weinberg平衡检验结果 根据PCRRFLP和基因测序测序的结果统计实验个体中的GG、GA和AA基因型的数目，利用Hardy-Weinberg遗传平衡定律，计算观察组和对照组各个基因型的实际值和期望值。通过χ2检验表明，本实验选择的实验群体中的基因型频率分布的期望值和实际值比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明群体中TNF-α基因-308位点的基因型符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。进一步表明本研究采用的研究对象具有群体代表性（见表1）。

图1　PCR-RFLP基因分型

表1　两组TNF-α基因-308位点基因型的遗传平衡检验

2.3TNF-α基因-308位点的基因型和等位基因的分布 观察组三种基因型AA，AG和GG的频率分别为5.43%、23.91%和70.65%，而对照组为1.09%，8.15%和91.85%，两组均以GG基因为主，3种基因型的分布差异均有统计学意义（χ2=6.16，P＜0.05）。观察组A，G等位基因频率的构成比分别为17.39%和82.61%，而对照组为8.15%和91.85%，两组间等位基因分布比较差异有统计学有意义（χ2=6.25，P＜0.05）。见表2。

表2　TNF-α基因-308位点的基因型和等位基因的分布频率 ［n（%）］

2.4TNF-α基因-308位点的基因多态性和等位基因与肺炎支原体肺炎易感性分析 本研究通过AA和GA基因型对GG基因型和等位基因A对G的优势比（OR）的计算，来表征基因型与肺炎支原体肺炎感染的相关性。结果如表3所示，GA和AA基因型OR值均大于1，表明这两种基因型人的发病风险增加。但是经过χ2检验，两组之间P值均大于0.05，差异并不显著。而观察组等位基因A的基因频率（17.39%）显著高于对照组（8.15%）。上述结果说明等位基因A与肺炎支原体肺炎易感性有关联，含有等位基因A个体的发病率为G的2.37倍。

表3　TNF-α基因-308位点的基因多态性和等位基因与肺炎支原体肺炎易感性的关系

2.5血清TNF-α蛋白浓度及与基因型的关联分析 经过酶联反应测得观察组血清TNF-α蛋白浓度显著高于对照组（见图2）。进一步对观察组TNF-α蛋白浓度与TNF-α基因-308位点基因多态性进行相关分析发现，观察组中AA基因型患者TNF-α蛋白的蛋白浓度最高（16.52±0.53），其次是GA基因型（12.85±0.91），GG基因型患者TNF-α蛋白的蛋白浓度最低（10.34±1.24），且三组间差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图2　观察组和对照组间TNF-α蛋白浓度浓度的比较

3　讨论

研究发现TNF-α启动子区-308位点核苷酸的多态性与各种疾病的发病率显著相关。Sakao等［6］用PCR技术检测日本群体中慢性阻塞性肺疾病（COPD）组和对照组血淋巴细胞的基因DNA，发现TNF-α基因型在两者间有明显不同，且-308位上AA纯合子和GA杂合子基因型均使COPD的发病风险增加。在我国江西、山东等地，TNF-α-308启动子基因的多态性与支气管哮喘发病的风险有关［7-8］。另外，TNF-α-308位点的多态性与肺癌的易感性也有密切的关系。Shih等［9］通过Logistic回归分析发现肺癌组TNF-α-308 G/A和A/A的基因型频率高于G/G型。在本资料中，观察组等位基因A的基因频率高于对照组，含有等位基因A个体的发病率是G的2.37倍。表明等位基因A可能与肺炎支原体肺炎易感性之间具有一定的关联。

TNF-α基因多态性与TNF-α的功能相关，基因启动子区的多态性可能会影响其转录水平，进而影响疾病的发展和预后［10-11］。Gonzalez等［12］报道TNF-α启动子区-308位点核苷酸G被A替换后，TNF-α基因转录效率增加7倍。体外研究发现，TNF-α基因在-308位上有A/G的转换，当用脂多糖刺激后，A等位基因的杂合子个体产生的TNF-α较GG基因型多［13］。本资料结果显示，TNF-α基因308位点处为AA基因型的肺炎支原体肺炎患者的TNF-α浓度显著高于GA和GG基因型，表明TNF-α基因308位点处的G/A突变与肺炎支原体肺炎患者TNF-α的水平间具有重要的关系。TNF-α基因启动子区域内转录起始位点上游第308位点G/A突变能显著影响TNF-α基因的表达水平。支原体肺炎患者血清中TNF-α的水平与支原体肺炎存在显著相关性，其水平可为支原体肺炎诊断和治疗提供理论依据和参考［14］。因此，TNF-α基因启动子区域内转录起始位点上游第308位点的突变对支原体肺炎病情的判断和治疗可能具有一定的作用。

综上所述，肺炎支原体肺炎患者TNF-α基因在308位点处存在AA，GA和GG 3种基因型，且均与正常人出现频率具有显著性差异。进一步研究发现A等位基因可能是调控TNF-α基因在肺炎支原体肺炎患者表达的重要因素，且与肺炎支原体肺炎的发生具有异性的关联。从TNF-α基因308位点处的G/A突变着手，可为肺炎支原体肺炎的诊断和治疗提供一定的依据和方向。

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Objective To provides a theoretical basis for the prevention and treatment of the mycoplasma pneumoniae pneumonia by studing the single nucleotide polymorphism of human TNF-α-308. Methods The actual and expected value of each genotype in the disease group and control group and the diatribution frequency of the genotype and allele were calculated. A total of 92 cases in mycoplasma pneumoniae pneumonia（diease group）and 92 subjects in control healthy people（control group）were studied in the present study. Single nucleotide polymorphism in the TNF-α-308 were detected by PCR-RFLP. The actual and expected value of each genotype，and the diatribution frequency of the genotype and allele were calculated. The DNA sequencing analysis was used to detect TNF-α 308 site polymorphism，and analyze the relationship between susceptibility of mycoplasma pneumoniae pneumonia and TNF-α 308 site polymorphism. The concentration of serum TNF-α was measured using ELISA kits. Results There were wild type（GC），hybrid type（GA）and mutant type（AA）in the site of TNF-α-308 .The genotypes in diease and control group were GG in majority there genotypy in hunman the differences of genotype and allele above between two groups were all statistical signifi cant（P＜0.05），The difference of genotypes GA and AA were not signifi cance. There were remarkably relevance between allele A and the susceptibility of mycoplasma pneumoniae pneumonia（P＜0.05）. Serum level of TNF-α in disease group was signifi cantly higher than that in control group. Conclusions There is a certain connection between the single nucleotide polymorphism of human TNF-α-308 and the usceptibility of mycoplasma pneumoniae pneumonia

TNF-α Polymorphism Mycoplasma pneumoniae pneumonia Genotyping

710000 第四军医大学第一附属医院呼吸科