再生纤维素微球对菠萝蛋白酶吸附工艺研究

宁玉娟　周培林　张海明　苏　宸　黄科林　蓝　平

（1.广西民族大学化学化工学院，广西 南宁 530006；2.中国科技开发院广西分院，广西 南宁 530006）

再生纤维素微球对菠萝蛋白酶吸附工艺研究

宁玉娟1周培林1张海明1苏宸1黄科林2蓝平1

（1.广西民族大学化学化工学院，广西 南宁 530006；2.中国科技开发院广西分院，广西 南宁 530006）

文章采用反相悬浮聚合法制备甘蔗渣再生纤维素微球，以菠萝蛋白酶为吸附模型，考察单因素对菠萝蛋白酶吸附量的影响，并测定菠萝蛋白酶酶活及吸附率。结果表明：温度313.2 K、pH为9、t为40 min、C0为1000 mg·L-1和振荡速率为200 r·min-1时最佳，最后微球对菠萝蛋白酶的最大吸附量为136.2 mg·g-1，酶活为0.1～0.25 F.I.P-U·g-1，吸附率为22.56～80.40 %。

再生；纤维素微球；菠萝蛋白酶；吸附；工艺

1　概述

吸附效果一般用模型蛋白吸附量来衡量，吸附剂性能好差通常与其物理化学性质、种类、孔隙率等有关，还与吸附外界环境条件紧密相关，比如说环境温度、体系pH、吸附质浓度等。

随着菠萝蛋白酶在食品［1-3］、日化［4］、医药［5，6］等行业中发挥着越来越重要的作用，国内外的很多专家对它的提取方法进行了大量的研究，目前运用到工业化生产的有单宁沉淀法、高岭土吸附法和超滤浓缩法［7，8］。目前，离子交换层析法和电泳法可用于菠萝蛋白酶分离纯化，并且已经得到了单组分［9-11］，但是，由于纯化的材料价格昂贵，所需的成本高，未能进行大规模化生产。目前工业上对菠萝蛋白酶的提取有大量文献，而甘蔗渣再生纤维素微球对菠萝蛋白酶的吸附未见相关报道，本章拟设计单因素实验优化微球对菠萝蛋白酶的吸附工艺，为纤维素基吸附材料的开发与应用提供理论前提和实践依据。

2　实验试剂与仪器设备

2.1实验试剂

表1　药品与仪器列表

2.2仪器和设备

表2　仪器设备列表

2.3实验内容

2.3.1微球的制备

参照钟明良［12］方法制得甘蔗渣再生纤维素微球。

2.3.2不同pH缓冲溶液的配制

按Henderson-Hasselbalch方程配制pH值，用分析天平准确称取6.1 g Tris（C4H11NO3）精确到0.0001 g，在室温条件下，使之溶于500 mL的超纯水中，用pH计验证，若有偏差用事先配制好的1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH溶液将其调至所需pH值。

2.3.3标准溶液液配制

用分析天平精确称量0.14g菠萝蛋白酶溶于一定量超纯水中，制成100.00mL标准母液，然后取不同体积的母液稀释成浓度为200、400、600、800、1000、1200、1400 mg·L-1的菠萝蛋白酶溶液，定容后摇匀于275 nm下测不同浓度的吸光度值，以酶溶液对吸光度值作图，得标准曲线。

2.3.4测定酶活

主要有C.D.U.法、G.D.U.法、F.I.P.法和快速测试法［13］，本实验采用F.I.P法测定酶活。

2.3.4.1各试剂的配制

所需各试剂参照实验方法配制［14］。

2.3.4.2测定酶活操作步骤

准备两支15 mL洁净试管①和②，移液管精确量取2.5 mL底物溶液分别放入①和②置于超级恒温槽，调至35 ℃；然后量2.5 mL的酶制备溶液，移置另外两支编号③和④试管中，把③和④试管放入35 ℃±0.20C的恒温槽预热两分钟；③号管加入底物溶液并摇匀，计时恒温10 min，随后移入5.0 mL的蛋白质凝固剂，终止反应；④试管加入5.0 mL蛋白质凝固剂之后，再迅速加入经预热酶制备溶液，恒温30 min，过滤，④号管作空白对照，在紫外波长275 nm下测其吸光度值。

2.3.4.3酶活的计算

计算酶活可参照施特尔马赫酶［13］所著酶活测定一书：

式中：

EF.I.P.——一个F.I.P.菠萝蛋白酶单位酶活（F.I.P.-U/g或F.I.P.-U/mL）；

A275——酶试样在275 nm处的吸光度；

W——酶试样量（g或mL）；

0.126——0.1μmol/ml酪氨酸溶液在275nm处的吸光度；

10——反应时间（min）

2.3.5静态吸附

本课题以甘蔗渣再生纤维素微球为吸附剂，以菠萝蛋白酶溶液为模型，静态吸附测其吸附量。精确称重一定质量微球于100 mL锥形瓶，移取25 mL浓度为1000 mg·L-1待测液，用封口膜封住瓶口预防待测液飞溅，升至至预定温度振荡一定时间，离心后取清液，275 nm下测，并重复以上步骤三次计算平均吸光度值。

注：qt为t时刻吸附量，mg·g-1；qe为饱和吸附量，mg·g-1；C0为初始浓度，mg·L-1；Ct为t时刻待测液的浓度，mg·L-1；M为微球质量，g；V为菠萝蛋白酶溶液的体积，mL。

2.3.6吸附率测定

吸附率等于吸附后待测液浓度与原液浓度的百分比。

式中：C0为初始浓度，mg·L-1；Ct为t时刻溶液浓度。

2.4结果与讨论

2.4.1标准曲线测定

按2.3.3步骤绘制其标曲，如下：

图1　菠萝蛋白酶标准曲线

从图1知，标准曲线方程如下。

其相关系数R2=0.9992，说明其线性关系良好，即可用于推算吸附前后菠萝蛋白酶的浓度差，计算出它的吸附量。

2.4.2单位酶活

参照步骤2.3.4和式（1）计算，其酶活为0.1～0.25 F.I.P-U·g-1之间。

2.4.3吸附率计算

由式（4）计算知：微球对菠萝蛋白酶吸附率为22.56～80.40 %之间。

2.4.4单因素实验

以甘蔗渣再生纤维素微球为吸附剂，以菠萝蛋白酶为模型蛋白，采用静态吸附进行吸附实验，考察菠萝酶溶液初始浓度C0、时间t、温度T、振荡速率V、溶液pH等工艺条件的影响。

2.4.4.1初始浓度的影响

拟设计C0为400、600、800、1000、1200、1400 mg·L-1条件下测其对菠萝蛋白酶的吸附效果的关系，结果如下：

图2　初始浓度与吸附效果关系

从图2可知，吸附量随着C0加大呈现快速上升趋势，而当C0过大时甘蔗渣再生纤维素微球吸附量迅速饱和后，不能继续吸附菠萝蛋白酶，而持续振荡会导致部分吸附上的菠萝蛋白酶被脱附下来，表现出来的及时其吸附量又呈现下降趋势，当溶液浓度为1000 mg·L-1时，其吸附达到最大值89.0 mg·g-1，故选取C0为1000 mg·L-1最佳。

2.4.4.2温度的影响

拟设计T为293.2、298.2、303.2、310.2、313.2、318.2 K条件下测T对菠萝蛋白酶的吸附效果关系，结果如下：

图3　温度与吸附效果关系

从图3可知，对比C0与吸附效果关系来说，温度对其影响较小，随着T升高吸附量增大，对模型蛋白吸附量先增大后略微下降，在振荡温度为313.2 K时，吸附量达到最大值92.9 mg·g-1。当温度高于318.2 K时，菠萝蛋白酶变性导致其自身结构发生变化，减少其接触机会故吸附量下降。

2.4.4.3吸附时间的影响

拟设计振荡时间为10、20、40、60、80、100、120 min条件下测其对菠萝蛋白酶吸附效果的关系，结果如下：

图4　时间与吸附效果关系

从图4可知，在t为10～40 min内，菠萝蛋白酶的吸附量随时间的增加而快速上升，而在40 min后直至120 min期间内，菠萝蛋白酶的吸附量几乎变化不大，笔者可以认为吸附40 min后吸附量达到最大值为98.8 mg·g-1，故选取振荡时间为40 min。

2.4.4.4振荡速率的影响

考察振荡速率V对吸附效果的影响，拟设计V为0、50、100、150、200、250 r·min-1条件下测其对菠萝蛋白酶吸附量的关系。

图5　速率与吸附效果关系

从图5可知，振荡速率V对吸附效果的影响很大，振荡速率越快吸附效果越好，当V在0～50 r·min-1间，吸附相同的时间内其吸附量变化不明显，是因为振荡速率过小甚至静置甘蔗渣再生纤维素微球与溶液接触不充分，液质混合不均匀导致部分微球吸附不完全；而当速率由50 r·min-1升至100 r·min-1时吸附量显著上升，随之上升趋势减弱，速率由200 r·min-1提升至250 r·min-1时吸附量变化不大，但是振荡速率过高会造成溶液飞溅出锥形瓶和吸附剂黏在瓶壁上，导致实验结果不准确。故本实验选取振荡速率由200 r·min-1为最佳，

此速度下甘蔗渣再生纤维素微球的吸附量为106.4 mg·g-1。

2.4.4.5体系pH的影响

拟设计体系pH分别为4、5、6、7、8、9、10条件下测其对菠萝蛋白酶吸附效果的关系。

图6　体系pH与吸附效果关系

从图6可知，其吸附量随体系pH值不断上升而逐渐上升至最大后急剧下降，表现为：pH=9时吸附量最大为111.2 mg·g-1，而当体系pH=10时吸附量急剧下降，降至最小值59.3 mg·g-1。等电点（菠萝蛋白酶）约为9.55，当体系pH=9时，菠萝蛋白酶分子上正负电荷几乎能相互抵消，在pH为10时失活，菠萝蛋白酶变性使其结果发生变化从而影响菠萝蛋白酶的吸附量［15］。分析认为，体系pH值得改变影响纤维素微球与菠萝蛋白酶之间的静电作用，再加上疏水基的影响，促进了吸附行为进行，所以当体系pH高于或低于其等电点，菠萝蛋白酶表面所含负电荷增多，两者之间的静电排斥力影响吸附行为，直观表现为吸附量下降。

2.5结论

本章以甘蔗渣再生纤维素微球为吸附剂，以菠萝蛋白酶为模型蛋白，采用静态吸附进行吸附实验，考察菠萝酶溶液初始浓度C0、时间t、温度T、振荡速率V、溶液pH等吸附工艺的影响。最佳方案为：C0为1000 mg·L-1、温度313.2 K、pH为9、t为40 min和振荡速率为200 r·min-1时最佳，微球对菠萝蛋白酶的最大吸附量为136.2 mg·g-1，酶活为0.1～0.25 F.I.P-U·g-1之间，微球吸附率为22.56～80.40 %之间。

［1］ Ram Saran Chaurasiya， H.Umesh Hebbar，et al. Response surface optimization of bromelain-assisted gelatin extraction from surimi processing wastes［J］.Food Bioscience，2014，5: 9-18.

［2］ K.Pillai，A.Ehteda，J.Akhter，et al.P0203 Anticancer effect of bromelain alone and in combination with cisplatin or fluorouracil on malignant peritoneal mesothelioma cells［J］. European Journal of Cancer， 2014，50（4）:66.

［3］ Sunantha Ketnawa，Phanuphong Chaiwut，Saroat Rawdkuen. Pineapple wastes: A potential source for bromelain extraction［J］.Food and bioproducts processing，2012，90（3）: 385-391.

［4］ 张艳丽，邵龙泉.一种新型酶激活漂白牙膏的疗效［J］. 中国口腔医学继续教育杂志，2013（3）:177-180.

［5］ Pandjaitan， Maruli， Nugraha. Bromelain Enzyme in Fresh Pineapple Juice as a Healing Pathway for HIV/AIDS［J］. Advanced Science，Engineering and Medicine，2014，6（1）: 119-123.

［6］ Jane E.Onken，Paula K.Greer，Brian Calingaert，Laura P. Hale. Bromelain treatment decreases secretion of pro-inflammatory cytokines and chemokines by colon biopsies in vitrio［J］. Clinical Immunology，2008，126（3）:345-352.

［7］ 王燕，赵力超.菠萝蛋白酶工业化提取工艺的改良及酶学性质研究［J］.食品工业科技，2011，32（10）:65-68， 353-357.

［8］ 王平诸，孙军社.菠萝蛋白酶的三种生产工艺比较［J］.河南化工，2002（7）:1-3.

［9］ Helber B.Costa，Patricia M.B.Fernandesi，Wanderson Romao，et al.A new procedure based on column chromatography to purify bromelain by ion exchange plus gel filtration chromatographies［J］.Industrial Crops and Products，2014（59）: 163-168.

［10］ Ram Saran Chaurasiya， H.Umesh Hebbar，et al. Extraction of bromelain from pineapple core and purification by RME and precipitation methods［J］. Separation and Purification Technology，2013（111）: 90-97.

［11］ Paulo A.G.Soares，Antonio F.M.Vaz，Maria T.S.Correia， et al. Purification of bromelain from pineapple wastes by ethanol precipitation［J］.Separation and Purification Technology，2012，98: 389-395.

［12］ 钟明良.甘蔗渣再生纤维素微球对牛血清蛋白的吸附性能研究［D］.南宁:广西大学，2014.

［13］ 施特尔马赫.酶的测定方法［M］.钱嘉渊，译.北京:中国轻工业出版社，1992:9-101.

［14］ 易元龙.从菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究［D］.南宁:广西大学，2009.

［15］ Dubinin M.M.，Zaverina E.D.， Radushkevich L.V. Sorption and structure of activated carbons. I. Adsorption of organic vapours［J］.Zh. Fiz.Khim，1947，21（11）:1351-1362.

Adsorption technology to bromelain from cellulose microspheres

The optimal preparation condition and physio-chemical properties of microspheres were studied. The adsorption model of the regenerated cellulose microspheres to pineapple proteinase was discussed and the influencing factors were also investigated in the adsorption process.The enzyme activity and adsorption rate to bromelain were determinated. The results showed that the temperature313.2 K， pH 9， time 40 min， concentrations on the adsorption capacity of bromelain 1000 mg·L-1and speed 200 r·min-1were best. Finally the maximum absorptive capacity of microspheres was 136.2 mg·g-1， the enzyme activity was 0.1～0.25 F.I.P-U·g-1， also the adsorption rate was 22.56～80.40 %.

Regeneration； cellulose microspheres； bromelain； adsorption； technology

O636.11

A

1008-1151（2016）04-0038-04

2016-03-13

广西民族大学—广西化工研究院研究生联合培养基地专项资助（BZD-001）；广西民族大学研究生创新项目（gxun-chxs2015085）；

宁玉娟（1989－），女，广西民族大学化学化工学院在读硕士，研究方向为天然高分子材料的改性。

黄科林（1963－），男，中国科技开发院广西分院教授级高级工程师，博士，研究方向为天然高分子材料的合成与改性。