白血病相关基因MLAA-34与急性单核细胞白血病相关性探讨*

西安交通大学第二附属医院血液科(西安 710004)

张鹏宇 罗 静 赵 璇△ 张龙进 雷 博 蒙 欣 田 玮 陈银霞 张王刚



白血病相关基因MLAA-34与急性单核细胞白血病相关性探讨*

西安交通大学第二附属医院血液科(西安 710004)

张鹏宇 罗 静 赵 璇△张龙进 雷 博 蒙 欣 田 玮 陈银霞 张王刚

目的：探讨白血病相关基因MLAA-34表达与急性单核细胞白血病(M5)患者疾病特征的关系,及对M5患者化疗缓解率和总生存期的影响。方法：应用 RT-PCR 方法对58例M5患者、12例正常健康人骨髓细胞MLAA-34 mRNA 的表达水平进行检测，统计分析MLAA-34与M5患者的相关性。结果：M5患者的MLAA-34表达量显著高于正常对照组；MLAA-34高表达组患者外周血象白细胞计数更高,异常核型的比例明显升高；M5患者CR后MLAA-34表达水平较治疗前明显下降；M5复发患者,MLAA-34的表达显著高于其初发时的水平；MLAA-34高表达组对化疗反应性差,CR率低,中位生存时间短。结论：MLAA-34是和M5发生、发展相关的肿瘤相关基因,其高表达是M5患者的一个高危预后因素。

急性单核细胞白血病(M5)是急性髓性白血病中较常见的类型,病情进展快,预后差。由于目前尚未鉴定出M5相关的特异性分子标志物，对于大多数M5患者仅能通过临床特征进行分层和预后判断。为此,我们课题组前期已应用Stratagene公司的λZAP定向克隆表达系统成功地构建了具有单核细胞分化特点的人U937细胞定向克隆cDNA表达文库,并采用M5型白血病患者的混合血清对所建文库进行筛选,发现35条M5抗原新基因(序列全部在GenBank登录)。应用crELISA技术对这些抗原新基因进行抗体特异性表达的小样本(各23例)检测,鉴定出具有特异性抗体、阳性率高的M5抗原新基因MLAA-34[1]；应用RACE技术克隆出其基因的全长cDNA序列(已在GenBank登录,序列编号：AY288977.2)；通过生物信息学分析发现：MLAA-34基因是功能未知基因CAB39L的一个新的剪接变体；应用RNAi 技术研究发现MLAA-34基因是和M5发生相关的新的抗凋亡分子[2]；慢病毒介导过表达MLAA-34的U937细胞可显著抑制细胞凋亡,并增加潜在的致瘤性；应用免疫共沉淀,鸟枪法测序和生物信息学分析示71种蛋白质参与了MLAA-34基因可能的信号通路[3]。前期,我们应用实时荧光定量 RT-PCR及Western Blot技术小样本检测发现：MLAA-34基因的mRNA及蛋白水平在M5患者白血病细胞中特异性高表达[4]。本研究进一步分析MLAA-34基因表达与M5患者疾病特征的关系,及对M5患者化疗缓解率和总生存期的影响。

对象与方法

1 研究对象 选取2013年10月至2015年10月我科收治的初诊M5患者58例，其中男37例，女21例，年龄18～71 岁，中位年龄44.5岁。所有患者均经骨髓细胞形态学、流式细胞术检测的白血病免疫分型、骨髓细胞的染色体核型分析、白血病常见基因(NPM1、FLT3和C-KIT)的突变检测确诊。患者的骨髓标本采取于初诊、诱导化疗后及白血病复发时。另取12例健康志愿者骨髓作为对照组,其中男6例,女6例,中位年龄39.2岁。骨髓及外周血单个核细胞收集后-80 ℃留存备用,所有人员均获知情同意并签署书面同意书。

2 治疗方案、疗效判定及随访 选取的初治M5患者应用MA方案或TA方案进行诱导缓解化疗，MA方案：米托蒽醌 8 mg/m2，d1-3，阿糖胞苷 150 mg/m2，d1-7；TA方案：吡柔比星 50 mg/m2，d1-3，阿糖胞苷 100 mg/m2，d1-7。7 d的诱导化疗方案未完成之前，患者如合并感染、严重骨髓抑制而生命体征不稳定者可停药。第一个化疗疗程未完成的患者,视为放弃治疗；诱导缓解治疗完成后观察疗效及缓解率,纳入统计指标。疗效判定按照张之南等[5]的血液病诊断及疗效标准,分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)以及未缓解(NR)。白血病复发的诊断指标：缓解后骨髓白血病细胞>5%,但<20%,经有效的抗白血病治疗一个疗程仍未达CR者；骨髓白血病细胞>20%；或临床出现髓外白血病浸润(骨髓及血象仍正常)三项之一。随访起自患者初次就诊日期至2015年10月10日止。

3 主要试剂及检测方法 淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂；Trizol 试剂购自 Invitrogen 公司；RNA 反转录试剂盒购自立陶宛Fermentas公司；pMD18-T 载体购自 Promega Biotech公司；Taq DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司。应用 RT-PCR 方法对 M5患者及对照组骨髓的 MLAA-34 mRNA 的表达水平分别进行检测。对 AML-M5 患者不同病程阶段(初诊、完全缓解、部分缓解或未缓解及复发) 的 MLAA-34 mRNA 的表达水平进行检测并分析。骨髓单个核细胞的分离、cDNA 的合成、实时荧光 RT-PCR 检测见参考文献[4]。MLAA-34 mRNA的引物序列和Taqman探针序列、内参β-actin基因的引物序列、及产物长度,见表1。引物及探针均 委托中山大学达安基因公司合成。

表1 RT-PCR反应的引物及探针序列

4 统计学方法 运用SPSS 22.0 统计学软件；计量资料呈非正态分布，用中位数(M)描述，两样本中位数比较采用 Mann-Whitney 检验，多个样本间的中位数比较采用 Kruskal-Wallis 检验。率的比较采用 χ2检验。P< 0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 初发的M5患者与对照组MLAA-34 mRNA的表达水平 见表2。Mann-Whitney Test统计表明，M5患者MLAA-34的表达水平显著高于对照组(P< 0.05)。

表2 初发M5患者与对照组MLAA-34 mRNA的表达水平

2 初发的M5患者临床特征与MLAA-34基因表达的关系 初发M5组患者MLAA-34表达的中位值为7.16×102，以中位值为标准将M5患者分为高表达MLAA-34组和低表达MLAA-34组，每组29例。应用Mann-Whitney Test统计分析的比较结果表明：①患者的年龄、性别与MLAA-34基因的表达无关,两组间无统计学差异。②与MLAA-34低表达组患者相比,高表达组患者外周血白细胞计数更高，两组间有统计学差异(P<0.05)；骨髓穿刺检查原始细胞比例也高,但两组间差异没有统计学意义(P>0.05)。③两组的染色体核型分析结果表明，两组共有23例患者被检出异常核型，包括涉及11q23的缺失或易位及+8,9q-等,MLAA-34高表达组异常核型的检出率明显增高,两组之间的差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 初发M5患者临床特征与MLAA-34基因表达的关系(n=25)

3 M5患者骨髓缓解状态与MLAA-34基因表达的关系 为了解M5患者不同病程阶段(初诊、完全缓解、部分缓解、难治或复发)其MLAA-34表达水平的变化，对30例M5患者进行了MLAA-34 mRNA表达的跟踪检测。结果发现：M5完全缓解(CR)的患者MLAA-34 mRNA表达水平较治疗前显著下降(P<0.05)；M5部分缓解及未缓解的患者MLAA-34表达水平与初治组无统计学差异； M5复发患者MLAA-34表达水平显著高于初治组(P<0.05)。见表4。

表4 M5患者骨髓缓解状态与MLAA-34基因表达的关系

4 MLAA-34基因表达与M5缓解率的关系 58例初发急性单核细胞白血病中，经诱导缓解方案化疗后，1例患者未完成首次化疗即因出现严重并发症死亡，2例患者未完成首次诱导缓解放弃治疗。在可分析的55例患者中，63.4% (35例)的患者达到完全缓解。其中MLAA-34低表达组患者完全缓解率为75%(21/28)，高表达组患者完全缓解率为51.9% (14/27)，MLAA-34低表达组患者CR率显著高于高表达组，差异具有统计学意义(χ2=4.371,P<0.05 )。

5 MLAA-34基因表达与M5预后的关系 MLAA-34基因低表达组患者中位生存时间为18个月，高表达组患者中位生存时间为10.5月。MLAA-34基因低表达组总生存率显著高于高表达组患者 (76.2% VS 53.2%,P<0.05)。

讨 论

白血病的发生是一个多步骤的复杂过程，目前具体的过程及发病机制尚不清楚；但研究已经证实，基因突变、染色体易位等基因组的异常在白血病的发生过程中起着重要作用。在急性白血病的发生中主要有两类基因突变起着重要作用，一类是累及酪氨酸激酶的基因突变、重排，使得酪氨酸激酶活性持续激活，从而导致造血前体细胞获得增殖/生存优势，比如：BCR/ABL、KIT、TEL/PDGFβR、K-RAS N-RAS、及FLT3内部串联重复等突变；第二类是累及转录因子的突变，导致机体造血祖细胞分化成熟障碍、阻滞其正常的凋亡,比如：AML1/ETO、PML/RARα、NUP98/HOXA9、CBFβ/SMMHC、C/EBPα和AML1基因点突变等。当第一类突变单独发生时会产生CML样病变，第二类突变单独存在是将导致似骨髓增生异常综合征样(MDS-like)的临床表现。只有以上两类突变同时具备时方可导致白血病的发生，这就是目前被大多数人接受的AML发生的多次打击学说[6]。

基于对白血病的发病机制的认识,靶向药物给血液肿瘤的治疗带来了新的曙光,如针对BCR/ABL融合基因的靶向药物伊马替尼、PML/RARA融合基因的靶向药物全反式维甲酸和三氧化二砷,完全改变了慢粒及M3的治疗模式及预后[7]。为寻找M5特异性的治疗靶点,我们课题组通过构建人U937细胞定向克隆cDNA表达文库，通过筛选和鉴定发现了M5抗原新基因MLAA-34；初步研究发现MLAA-34基因是功能未知基因CAB39L的一个新的剪接变体；是和急性单核细胞白血病发生相关的新的抗凋亡分子。最近，我们课题组进一步研究了其可能的抗凋亡机制，发现MLAA-34基因的高表达不仅在白血病细胞株中具有抗凋亡作用，而且在宫颈癌HeLa细胞中同样具有抗凋亡作用[8]；并且发现其抗凋亡作用可能通过参与了β-Catenin/TCF4途径[9]。以上基础研究表明，MLAA-34是一个候选的白血病靶向基因。

本研究是我们既往工作的深入研究，采用特异的Taq Man探针进行定量PCR，统计分析表明：12例正常对照组其MLAA-34 mRNA表达水平极低或检测不到；M5患者的MLAA-34表达量明显高于正常对照组，结果与我们前期的小样本研究结果相一致[4]。进一步的分析发现：MLAA-34基因高表达与M5患者诊断时的不利的临床特征相关，与MLAA-34低表达组M5患者相比较，高表达组患者初发时外周血白细胞计数更高，发现异常核型的几率更高，差异有统计学意义。虽然高表达组骨髓原始细胞比例高于低表达组，但差异没有统计学意义，这可能与本研究样本量较小有关。进一步我们对30例M5患者的MLAA-34基因的表达进行了跟踪检测，发现M5患者经诱导化疗获得CR后其MLAA-34 mRNA表达水平较治疗前明显下降；尤其是M5患者复发后，MLAA-34的表达不但升高，而且显著高于其初发时的水平。并且，MLAA-34高表达组对化疗反应性差，CR率低；预后分析表明，其中位生存时间明显缩短。

本研究进一步从临床上证明了MLAA-34是和M5发生、发展相关的肿瘤相关基因，其特异性的在M5患者中表达，其高表达是M5患者的一个高危预后因素，有可能成为M5的治疗靶点。但本研究仍然存在一些不足，如所纳入的实验对象例数仍然偏少、为单中心研究、随访时间短；后续的研究需要扩大研究样本，争取多中心合作，深入作用机制研究，进一步探讨MLAA-34基因与急性单核细胞白血病的相关性及其作用机制。

[1] Chen G, Zhang W, Cao X,etal. Serological identification of immunogenic antigens in acute monocytic leukemia[J]. Leuk Res,2005,29(5)：503-509.

[2] Zhang PY, Zhang WG, He AL,etal. Identification and functional characterization of the novel acute monocytic leukemia associated antigen MLAA-34[J].Cancer Immunol Immunother,2009,58(2)：281-290.

[3] Zhang WJ,Zhang WG,Zhang PY,etal. The expression and functional characterization associated with cell apoptosis and proteomic analysis of the novel gene MLAA-34 in U937 cells[J]. Oncology Reports, 2013,29(2)：491-506.

[4] Zhao JQ,He AL,Zhang WG,etal. Quantitative assessment of MLAA-34 expression in diagnosis and prognosis of acute monocytic leukemia[J]. Cancer Immunol Immunother,2011,60(4)：587-597.

[5] 张之南,沈 悌.血液病诊断及疗效标准[M]. 3 版.北京:科学出版社，2008：219-228.

[6] Kansal R. Acute myeloid leukemia in the era of precision medicine: recent advances in diagnostic classification and risk stratification[J]. Cancer Biol Med,2016,13(1):41-54.

[7] 唐建琼,黎艳丽,岳小娅,等. 白血病干细胞及白血病靶向治疗研究进展[J].陕西医学杂志, 2014, 43(6): 758-760.

[8] 张鹏宇,赵 璇,张文娟,等. 白血病相关基因MLAA-34在HeLa细胞中的抗凋亡作用[J].中国实验血液学杂志,2016, 24(2): 363-368.

[9] Qian L, Zhang W, Zhang P,etal. The anti-apoptosis effect of MLAA-34 in leukemia and the β-catenin/T cell factor 4 protein pathway[J]. Am J Transl Res,2015,7(11):2270-2278.

(收稿：2016-07-25)

Correlation between leukemia associated gene MLAA-34 and acute mononuclear cell leukemia

Department of Clinical Hematology, The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University( Xi’an 710004)

Zhang Pengyu Luo Jing Zhao Xuan et al

Objective: To analyze the relationship between the expression of leukemia associated gene MLAA-34 and the disease characteristics of patients with acute leukemia (M5), and to investigate the effect of MLAA-34 expression on the remission rate and overall survival of patients with M5. Methods: RT-PCR method was used to detect the expression levels of mRNA in bone marrow cells of M5 patients and normal healthy people, and the correlation between MLAA-34 and M5 were statistically analyzed. Results: The expression level of MLAA-34 in M5 patients was significantly higher than that in normal control group; the high expression of MLAA-34 in patients with peripheral blood white blood cell count higher, abnormal karyotype increased significantly; the expression level of MLAA-34 in M5 patients after CR was significantly lower than that before treatment; the expression of MLAA-34 was significantly higher in the recurrent patients with M5 than the primary patients; MLAA-34 high expression patients had poor response to chemotherapy, low CR rate, and short median survival time.Conclusion: MLAA-34 is associated with the occurrence and development of M5, and its high expression is a high risk prognostic factors in patients with M5.

Leukemia, monocytic, acute Gene expression regulation, leukemic Prognosis @MLAA-34 gene

*国家自然科学基金资助项目(81000219)

△西安医学院基础部组胚教研室

白血病, 单核细胞, 急性 基因表达调控, 白血病 预后 @MLAA-34基因

R733.71

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.042