miR-99b在新辅助化疗宫颈癌组织中的表达*

陕西省人民医院(西安710068)

李连香 于翠革 陈丽宏 杨晓梅



miR-99b在新辅助化疗宫颈癌组织中的表达*

陕西省人民医院(西安710068)

李连香 于翠革 陈丽宏 杨晓梅

目的：研究miRNA-99b(miR-99b)在新辅助化疗宫颈癌组织中的表达。方法：宫颈癌患者55例分别于新辅助化疗前后收集肿瘤组织标本行micRNA的提取、反转录、实时定量PCR检测miR-99b的表达。结果：宫颈癌新辅助化疗后miRNA99b表达显著上升,与治疗前表达比较有统计学差异(P<0.05)。结论：新辅助化疗可通过上调miRNA-99b表达,实现对宫颈癌的抑制。

宫颈癌传统的治疗方法是手术和放疗,近年来宫颈癌的化疗逐渐成为关注和研究的热点。吴维光等[1]为探讨miRNA-99b(miR-99b)调控宫颈癌细胞增殖和诱导凋亡的可能机制,应用Western blot 检测了miR-99b 靶基因CDC-25A 蛋白表达,发现miR-99b 上调表达后,细胞CDC-25A 表达降低。表明miR-99b 可通过调控靶基因CDC-25A 表达,调控宫颈癌细胞的增殖和凋亡。据此分析,miR-99b 在宫颈癌的发生和发展过程中可能起重要作用,上调miR-99b 表达可抑制宫颈癌细胞增殖,诱导细胞凋亡。miR-99b 有可能成为宫颈癌治疗的靶基因。本研究在前期观察了新辅助化疗对巨快性宫颈癌的临床治疗效果的基础上,进一步研究miR-99b在新辅助化疗宫颈癌前后组织中的表达。

资料与方法

1 一般资料 收集2014年1月至2015年6月我科就诊的宫颈癌患者55例,年龄35～68岁,平均54岁。Ib2期25例,IIa期 18例,IIb～IVa期 12例。鳞癌39例,腺癌14例,鳞腺癌2例。高分化29例,中分化15例,低分化11例。55例患者分别于新辅助化疗前后收集肿瘤组织标本。

2 实验方法 ①组织中micRNA的提取：使用RNAiso for Small RNA(TAKARA D340A)试剂盒进行组织中RNA的提取。②反转录：使用One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis (TAKARA D350A)一步法miRNA反转录试剂盒进行miRNA反转录反应,取1000 ng RNA进行反转录。③实时定量PCR：使用SYBR Premix Ex TaqTMII (TAKARA DRR081)实时定量试剂盒进行实时定量检测。将反转录得到的20μl cDNA添加RNase Free dH2O补足至100μl。取2μl稀释液加入到Real Time PCR反应体系中,进行定量检测。③数据分析：使用ABI 7300分析软件,用双标准曲线法分析宫颈癌组织新辅助化疗前后miRNA表达水平变化,从has-miR-99b中挑选出表达水平变化趋势与芯片分析结果一致的miRNA,以Human_RNU1A作为内参。

结 果

1 组织中miRNA的提取 使用RNAiso for Small RNA小RNA提取试剂盒,从组织中提取small RNA，RNA比值在1.8～2.0,说明组织中的RNA质量完好,电泳图显示小RNA结果,如图1。

M：50bp DNA Ladder Marker；1, 2：small RNA

2 RT-PCR 电泳结果 以small RNA反转录的cDNA为模板,以miRNA上下游引物扩增目的片段,取8 μl qPCR产物进行3 % 琼脂糖凝胶电泳,结果显示扩增出来的miRNA即为目的片段,片段大小为90bp，结果如图2。

7,8：has- miR-99b Mix 扩增产物/平行样；1,2：阴性对照 dH2O

3 实时定量PCR验证结果 使用相对定量法检测新辅助化疗前后miRNA-99b，用标准曲线法校正批次之间的差异。通过定量扩增计算出miRNA-99b的标准曲线为：内参Human_RNU1A为：y=-3.62x+22.44；has-miR-99b为：y =-3.1x+31.13；其扩增效率为:1.04在0.8与1.2之间(见图3～5)。新辅助化疗治疗前后miR99b表达水平改变倍数发生了明显的变化,新辅助化疗后miRNA99b表达较治疗前表达明显增高(P<0.05)。

讨 论

目前,已发现多种microRNA(miRNA)与肿瘤发生相关,但与宫颈癌新辅助化疗治疗机制相关的miRNA仍在探索之中。有研究发现,miRNA-99b(miR-99b) 在人乳头瘤状病毒(HPV) 阳性的宫颈腺癌组织中低表达[2-3]。但这并不表明表达量有变化的miRNA分子都参与了肿瘤的形成。很多miRNA可能只是间接地受到癌变过程中基因组或生理变化的影响，而不是根本起因。目前癌症研究的主要目标之一是发掘真正与癌症形成相关的miRNA[4]。

现有的研究表明,在宫颈癌中,miRNAs表达分上调和下调两种。其中上调表达的miRNAs有miRNA-210，182,183,200c,203,193b,34a,31,210,27a,503,27b,199a,199b,145,133a,133b,214和127等。而下调表达的miRNAs包括：miRNA-126,145,451,195,143,199b,1,495,497,133b,223,146a,126-AS,150,376a,214,487b,10b,218,149和203等[5-6]。本研究通过前期试验发现新辅助化疗能明显降低巨块型宫颈癌的直径,增加手术机会,提高手术几率,为根治手术创造条件。通过实时定量PCR发现与宫颈癌新辅助化疗确切相关的miRNA为miRNA-99b。治疗后两者皆显著上升(P<0.05)。

miRNA-99b与宫颈癌的关系目前国外尚未见报道,国内报道较少。吴维光等[1]通过基因芯片发现miRNA-99b与HPV感染的宫颈癌相关。HPV感染的宫颈癌细胞miRNA-99b呈低表达。我们的研究也发现,经过新辅助化疗,宫颈癌组织中miRNA-99b呈上调趋势,较治疗前增加近6倍,且前期临床观察发现宫颈癌新辅助化疗后癌灶明显减小,证明了新辅助化疗可能通过上调miRNA-99b表达,促进宫颈癌细胞凋亡,从而达到抑制肿瘤的治疗效果。从此研究结果也证明了新辅助化疗将miRNA-99b作为宫颈癌治疗靶点的可能性。

综上所述,新辅助化疗可通过上调miRNA-99b表达,实现对宫颈癌的抑制。然而miRNA-99b的靶蛋白及其涉及的相关通路尚待进一步研究。

[1] 吴维光,孙小丽,陈 勃,等.microRNA-99b 表达调控对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的作用[J].现代妇产科进展,2008,17(10)：752-755.

[2] Zhou WY,Chen JC,Jiao TT,etal.MicroRNA-181 targets YinYang 1 expression and inhibits cervical cancer progression[J].Mol Med Rep,2015,11( 6) : 4541-4546．

[3] Wang L,Chang L,Li Z,etal.miR-99a and -99b inhibit cervicalcancer cell proliferation and invasion by targeting mTOR signalingpathway[J].Med Oncol,2014,31(5)：934．

[4] Yanihara N,Caplen N,Bowman E,etal. Unique microRNA molecμLar profiles in lung cancer diagnosis and prognosis[J]. Cancer Cell,2011,9(3)：189-198.

[5] Reshmi G,Radhakrishna PM.Beyond HPV:Oncomirs as new players in cervical cancer[J]. FEBS Letters,2008,582(30)：4113-4116.

[6] 任 俊. MicroRNA在肿瘤中的研究进展[J].医学综述,2012,18(8)：1170-1173.

(收稿：2016-02-23)

Expression of the miR-99b before and after neo adjuvant chemotherapy of cervical cancer

Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Li Lianxiang Yu Cuige Chen Lihong et al

Objective：To study the expression of the miR-99b before and after neo adjuvant chemotherapy of cervical cancer.Methods: Through micRNA extraction,reverse transcription, timing quantitative PCR detection the expression of miR-99b in the tumor tissue respectively before and after neoadjuvant chemotherapy in the patients with cervical cancer.Results: After neoadjuvant chemotherapy the cervical cancer miR-99b expression was significantly higher(P<0.05).Conclusion: Neoadjuvant chemotherapy can inhibition of cervical cancer through raising the expression of the miR-99b.

Uterine cervical neoplasms Gene expression regulation,neoplastic @miRNA-99b

*陕西省社发攻关资助项目(2010K01-156)

子宫颈肿瘤 基因表达调控,肿瘤 @miRNA-99b

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.007