白藜芦醇抑制胰腺癌裸鼠移植瘤生长的实验研究*

西安市中心医院普外二科(西安 710004)

秦 勇 马清涌△ 党晓燕◇ 孙师元◇▲



·论著·基础研究·

白藜芦醇抑制胰腺癌裸鼠移植瘤生长的实验研究*

西安市中心医院普外二科(西安 710004)

秦 勇马清涌△党晓燕◇孙师元◇▲

目的:观察白藜芦醇(Res)对人胰腺癌Miapaca-2(PC-2)细胞构建的胰腺癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,并探讨其作用机制。方法:建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型并随机分组,分别给予3种不同浓度的白藜芦醇干预后处死胰腺癌裸鼠,取出移植瘤,观察其体积、重量的变化情况；HE染色法观察移植瘤组织病理学变化；采用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)和Western bolt法测定移植瘤组织Bcl-2、Bax、p53蛋白和mRNA表达水平。结果：Res组移植瘤的体积、重量明显低于阴性对照组,随着浓度增加变化越明显(P<0.01)；3个浓度组白藜芦醇作用于胰腺癌裸鼠后,移植瘤组织中Bcl-2、Bax、p53蛋白和mRNA表达水平较阴性对照组差异具有统计学意义(P<0.01),且随着浓度增加表达水平的差异越明显。结论: 白藜芦醇可能通过调节Bcl-2、Bax、p53的表达来抑制胰腺癌移植瘤的生长。

白藜芦醇(Resveratrol,Res)是存在于虎杖、松树、葡萄等天然植物当中的多酚类化合物,对植物本身起保护作用[1]。研究发现Res具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多种生物学活性,近年来其抗肿瘤活性越来越引起人们的关注。有研究显示[2-3],Res在体外能抑制胰腺癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞的生长。但目前的研究多集中在Res对肿瘤细胞的体外研究,而有关Res对裸鼠移植瘤的体内研究甚少。本研究即通过建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型，观察Res对胰腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用,并通过RT-PCR和Western bolt法观察Res对移植瘤组织中Bcl-2、Bax、p53蛋白和mRNA表达水平的影响,以探索Res抑制胰腺癌裸鼠移植瘤生长的可能作用机制。

材料和方法

1 材 料 人胰腺癌细胞株Miapaca-2购自北京协和医学院。BALB/C裸鼠,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,30只实验用裸鼠,均为雌性,6周龄,体重在l4～l6 g之间。白藜芦醇购自美国Sigma公司,纯度<99.9%,用二甲基亚砜(DMSO)溶解后蒸馏水配成浓度为400 μmol/L,消毒后,-20℃冻存备用。5-FU注射液购自上海旭东海普药业公司。Bcl-2、Bax、p53一抗和二抗购自美国Sant Cruz公司。引物序列由Takara公司合成。PCR MasterMix购自Takara公司。其它常用试剂均为国产分析纯。

2 细胞培养及分组 人胰腺癌Miapaca-2细胞在37℃,5% CO2培养箱中,用DMEM培养液(含10%小牛血清、1% L-谷氨酰胺、100 mg/L链霉素、100 IU/ml青霉素)传代培养,待70%～80%融合时,用2.5 g/L胰酶进行消化传代后继续培养。取对数生长期的细胞准备造模。实验分5组：Res高浓度组(200 μg/ml)、中浓度组(100 μg/ml)、低浓度组(50 μg/ml)、5-FU组(750 μg/ml)、阴性对照组(生理盐水)。5-FU组为阳性对照组。浓度选择参照文献[4]。

3 胰腺癌裸鼠移植瘤模型制备 将BALB/C裸鼠饲养于无菌层流室内,每笼10只,每3 d换1次饲料、饮水及垫料,保持恒温25±2℃、恒湿45%～50%。取对数生长期的细胞,分别制成细胞浓度为1×108/ml的悬浮液,再用6号针头的注射器抽取200 μl细胞悬液，接种于裸鼠双侧大腿上方的背部皮下(每组10只)。以皮下结节直径达0.5 cm为成瘤标准,成瘤时间约为1周左右,1周后检查发现裸鼠体内肿瘤长径约0.8 cm,故判断胰腺癌裸鼠移植瘤模型造模成功,30只大鼠中有3只死亡,2只造模失败,所以造模后,随机将25只裸鼠分别入组,每组5只。

4 裸鼠抑瘤实验 5组裸鼠分别用5 ml注射器内穿刺针抽取0.2 ml等体积溶液(以培养液定容),对瘤体多点(1～4点)注射,1次/d,共14 d。给药期间每2 d测量裸鼠体重及移植瘤长径、短径。末次给药48 h后用脊髓脱臼法处死裸鼠,仔细、完整剥离移植瘤后,用PBS液快速冲洗,表面液体用滤纸吸干,然后用电子天平称进行称重,每个移植瘤的称重重复3次。用游标卡尺测量移植瘤的最长径L和短径W,每次重复3遍。肿瘤体积计算公式如下：V=L×W2/2,求其平均值。肿瘤重量抑制率(%)=(1-实验组肿瘤重量/对照组肿瘤重量)×100%，肿瘤体积抑制率(%)=(1-实验组肿瘤体积/对照组肿瘤体积)×100%。

5 移植瘤组织病理学检查 将移植瘤组织进行称重，再用4%多聚甲醛进行固定、脱水，最后石蜡包埋，常规4 μm切片，60℃烘箱烘干、冷却后HE染色,用中性树胶封片,光镜下观察各组移植瘤组织病理学变化。

6 移植瘤组织Bcl-2、Bax及p53蛋白检测 分别提取各组裸鼠移植瘤组织总蛋白,将其进行电泳后,转移至硝酸纤维膜上进行封闭,再分别与抗β-actin、Bcl-2、Bax及p53单克隆抗体进行杂交和二抗反应,最后行化学发光法检测阳性条带。

7 移植瘤组织Bcl-2、Bax及p53 mRNA检测 按上述分组,将裸鼠移植瘤组织总RNA用Trizol Reagent试剂盒进行提取，随后用Fermentas逆转录试剂盒将RNA转录为cDNA。PCR总反应体系为25 μl,内含2×Taq PCR Master Mix 12.5 μl,cDNA产物2 μl,正义引物1 μl ,反义引物1 μl 以及ddH2O(灭菌去离子水)8.5 μl。PCR 反应条件：预变性，94℃、5 min；变性,94℃、30 s；退火,60℃、30 s；延伸,72℃、30 s；共进行35个循环。最后于72℃延伸7 min后结束。引物序列β-actin：上游引物 5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3',下游引物 5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'，扩增基因片段长度为179bp；Ihh：上游引物 5'-CATTGAGACTTGACTGGGCAAC-3'，下游引物 3'-AGAGCAGGCTGAGTTGGGAGTCGC-5',扩增基因片段长度为405bp；Smo：上游引物 5'-CCTTTGGCTTTGTGCTCATTACCTT-3',下游引物 3'-CGT-CACTCTGCCCAGTCAACCT-5'，扩增基因片段长度为407bp；Ptch: 上游引物 5 -ATGCTGGCGG-GATCTGAGTTCGACT-3,下游引物 3' -GGGTGTGGGCAGGCGGTTCAAG-5',扩增基因片段长度为789bp。阴性对照总RNA的反应体系用灭菌去离子水代替进行逆转录及PCR扩增。然后各取9 μl PCR产物,加入 1 μl 10×Loading Buffer,经2.5%琼脂糖凝胶电泳40 min,在紫外透射分析仪下观察并拍照。通过GIS22009全自动数码凝胶图像分析系统进行各条带光密度的分析,β-actin作为内参基因评估各组Bcl-2、Bax及p53 mRNA的相对表达量。目的基因相对表达量按照2-ΔΔCt法计算。

结 果

1 不同组别裸鼠皮下移植瘤重量及体积变化 见附表。经过14 d处理后,Res高浓度组、中浓度组、低浓度组的移植瘤重量及体积明显小于阴性对照组(P<0.01)；Res高浓度组与中、低浓度组比较，移植瘤重量及体积之间也有明显差异，且随着浓度增加肿瘤重量及体积减小越明显(P<0.01)，但Res中、低浓度组之间差异不明显；与5-FU组比较，除Res高浓度组外，与其余各组均有统计学差异(P<0.01)；同时肿瘤重量及体积抑制率也呈现同样的变化。

附表 裸鼠皮下肿瘤体积及重量变化

注：与阴性对照组比较,*P<0.01；与5-FU组比较,#P<0.01；与Res高浓度组比较,▲P<0.01

2 移植瘤病理学特征 见图1。经石蜡切片后行HE染色,病理确诊为胰腺腺癌。光镜下的形态特点: 可见肿瘤细胞呈圆形、多角形,分布均匀,排列致密,细胞核呈圆形、椭圆形,染色质深染,分裂像多见,呈异质性,胞浆较少,略嗜伊红,细胞间质少见。阴性对照组基本全是胰腺癌组织，Res组还可见部分正常胰腺组织。

3 Western blot检测各组裸鼠移植瘤组织中Bcl-2、Bax及p53的蛋白表达水平 见图2。

图1 移植瘤病理切片(HE×400)

与阴性对照组比较,3组Res注射组中Bcl-2蛋白的表达明显下降(P<0.01)；与5-FU组比较,Res高、中浓度组Bcl-2蛋白显著下降(P<0.01)。与阴性对照组比较,3组Res注射组的Bax和 p53蛋白表达水平明显增高(P<0.01)，效应呈浓度效应关系；与5-FU组比较,Res高、中浓度组的Bax蛋白表达水平明显增高(P<0.01)，而Res 3个注射组的p53蛋白表达水平与5-FU组比较无明显差异。

(A: Res高浓度组；B: Res中浓度组；C: Res低浓度组；D: 5-FU组；E: 阴性对照组)(与阴性对照组比较，*P<0.01；与5-FU组比较，#P<0.01)

4 RT-PCR方法检测各组裸鼠移植瘤组织中Bcl-2、Bax及p53 mRNA的表达水平 见图3。结果显示：与阴性对照组比较,各浓度Res注射组中Bcl-2 mRNA的水平明显下降(P<0.01)，效应呈浓度效应关系；与5-FU组比较,Res高、中浓度组中Bcl-2的mRNA表达显著下降(P<0.01)。而与阴性对照组比较,各浓度Res注射组中Bax和 p53的mRNA水平均明显增加(P<0.01)，且效应呈浓度效应关系；与5-FU组比较,高浓度Res组中Bax的mRNA水平明显增高(P<0.01),而p53的mRNA水平在Res高、中浓度组中显著增高(P<0.01)。

(A: Res高浓度组； B: Res中浓度组；C: Res低浓度组；D: 5-FU组；E: 阴性对照组)(与阴性对照组比较，*P<0.01；与5-FU组比较，#P<0.01)

讨 论

建立胰腺癌裸鼠模型,在胰腺癌研究中是不可或缺的。它可以更好地模拟胰腺癌细胞在人体内的生物学行为[5-6]。本实验采用BALB/C裸鼠,其无T细胞免疫力,对异种移植无排斥反应,具有移植成功率高的特点,目前已广泛应用于各种肿瘤的基础研究[7]。

经过14 d处理后,对Res各浓度组移植瘤组织的重量、体积及其抑制率变化情况的观察发现,与阴性对照组相比,Res各浓度组对移植瘤生长均有不同程度的抑制作用,Res高浓度组、中浓度组、低浓度组的移植瘤重量及体积明显小于阴性对照组(P<0.01)；随着Res浓度的增加,移植瘤组织的重量、体积的减小越明显,但中、低浓度组之间的差异不显著；同时,Res高浓度组与5-FU组相比,两者对移植瘤重量、体积的影响并没有明显差异(P>0.05),其抑制率的变化也呈现同样的特点。移植瘤的病理切片也证实了Res的抑瘤效果。故表明Res对胰腺癌裸鼠Miapaca-2细胞株移植瘤的生长具有一定的抑制作用,特别是Res的浓度达到一定程度时,其对胰腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用与5-FU的效果基本相同，进一步说明Res对胰腺癌裸鼠移植瘤的抑制效果与其浓度有关。

肿瘤的发生、发展与肿瘤细胞凋亡与增殖之间的失衡有关,肿瘤细胞的凋亡由凋亡相关基因决定。细胞凋亡基因可分为凋亡促进基因和凋亡抑制基因两大类,其中Bcl-2是一种凋亡抑制基因,Bax是一种凋亡促进基因。肿瘤是否发生凋亡与Bcl-2 和Bax两者的比例有关,Bcl-2占主导时抑制肿瘤细胞发生凋亡,Bax占主导时促进肿瘤细胞发生凋亡。p53是一种抑癌基因,其通过直接激活Bax基因的表达及下调Bcl-2基因的表达来诱导细胞发生凋亡[8]。有研究显示[9]：Res可通过促进肿瘤细胞发生凋亡,达到抑制肿瘤生长的作用。故我们又进一步测定了胰腺癌裸鼠移植瘤组织中Bcl-2、Bax、p53的表达情况,结果也发现,与阴性对照组比较，Res各浓度组能显著减少移植瘤组织中Bcl-2蛋白及mRNA的表达(P<0.01),且效应呈浓度依赖关系；同时发现其也能显著增加移植瘤组织中Bax、p53蛋白及mRNA的表达(P<0.01)，其效应同样呈浓度依赖关系。与5-FU组比较,除p53蛋白表达水平与5-FU组比较无明显差异外,Res高浓度组中Bcl-2的蛋白和mRNA表达显著下降(P<0.01)；Bax、p53的蛋白和mRNA水平明显增高(P<0.01)，表明Res可降低胰腺癌裸鼠移植瘤组织中Bcl-2的表达,增强Bax、p53的表达,且Res对Bcl-2,Bax、p53的影响效果与其浓度有关,呈浓度效应关系,其中高浓度Res的影响效果比5-FU更显著。

综上所述,Res可能通过下调Bcl-2的表达、同时上调Bax和p53的表达诱导人胰腺癌Miapaca-2细胞株发生凋亡,最终抑制胰腺癌裸鼠移植瘤的生长。这种抑制效果与Res的浓度有关,高浓度Res的抑制作用与5-FU的效果基本相同。但其确切的作用机制需要进一步研究。

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(收稿：2016-03-31)

The tumor inhibition study of resveratrol on pancreatic cancer cell xenograft in nude mice

Department of the Second General Surgery，Xi’an Central Hospital(Xi’an 710004)

Qin Yong Ma Qingyong Dang Xiaoyan et al

Objective：To investigate the antitumor effect of Resveratrol on pancreatic cancer Miapaca-2 cell xenograft on athymic. Methods：The pancreatic cancer Miapaca-2 cell xenograft model in nude mice was established and randomly divided into the blank group, the Res group and the saline negative control group. After intervention with Res, the mice was killed. The weight and volume of tumor were recorded. The pathological change of tumor tissue in each group was observed under microscope with HE staining.Real-time quantitative RT-polymerase chain reaction and western bolt assay were used to confirmed the expression of Bcl-2 and Bax、p53 in tumor tissue at mRNA and protein lever. Results：The weight and volume of tumor in Res group were less than those in the negative control group(P<0.01).RT-PCR and Western blot assay indicated Resveratrol of three different concentrations regulated the protein and mRNA expression of Bcl-2 and Bax、p53 in tumor tissue. At the same time ,the expression levels gradually changed as the concentration increased,the difference was significant (P<0.01) .Conclusion：Resveratrol inhibited the growth of pancreatic cancer Miapaca-2 cells xenograft. The effect may be related to the regulating of Bcl-2 and Bax、p53 at mRNA and protein lever.

Pancreatic neoplasms Neoplasm transplantation Rats,nude Tumor suppressor proteins@Resveratrol

*陕西省科技攻关项目(2011K13-01-15)

△西安交通大学第一附属医院肝胆外科

◇西安交通大学第二附属医院急诊科

▲通讯作者

胰腺肿瘤 肿瘤移植 大鼠,裸 肿瘤抑制蛋白 @白藜芦醇

R735.9

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.001