黄芪甲苷对A549细胞胸腺基质淋巴细胞生成素表达的影响

朱成华　杜强



黄芪甲苷对A549细胞胸腺基质淋巴细胞生成素表达的影响

朱成华杜强

目的观察黄芪甲苷对胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)基因表达的影响，并探讨此作用是否与核因子-κB(NF-κB)有关。方法肿瘤坏死因子-α(TNF-α)+白介素-4(IL-4)刺激A549细胞4 h、10 h和18 h后,使用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法观察A549细胞TSLP mRNA表达的变化;同时使用RT-PCR方法观察黄芪甲苷以及NF-κB抑制剂PDTC对TSLP mRNA表达的影响,使用免疫荧光观察NF-κB P65核转录的变化,并用western blot方法检测IκBα表达的变化。结果TNF-α+IL-4刺激A549细胞后TSLP mRNA表达明显增加,4 h时增加最明显,10 h逐渐下降,18 h后基本降到正常;PDTC能够显著抑制TSLP mRNA表达,而黄芪甲苷抑制作用不明显;黄芪甲苷能够显著抑制A549细胞NF-κB P65的核转录,升高胞浆IκBα的蛋白水平。结论气道上皮细胞A549细胞中NF-κB对TSLP基因具有重要的调控作用,黄芪甲苷能够升高胞浆IκB-α的蛋白水平,抑制NF-κB的核转录,但黄芪甲苷对TSLP的基因表达没有抑制作用。

核因子-κB; 胸腺基质淋巴细胞生成素; 黄芪甲苷

气道上皮细胞分泌多种细胞因子和生长因子,参与哮喘气道炎症和气道重塑的形成[1]。胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)是由气道上皮细胞分泌的一种细胞因子,在TSLP的表达调控中,核因子-κB(NF-κB)通路具有重要的作用[2-4]。黄芪甲苷具有抗炎、免疫调节等特性,其体外抗炎机制之一来源于对NF-κB通路的抑制[5]。我们既往研究表明:黄芪甲苷能降低哮喘小鼠肺组织TSLP的表达[6],本实验旨在探讨在Th2微环境下,黄芪甲苷是否影响支气管上皮细胞TSLP的表达,并探讨此抑制作用是否与NF-κB通路有关。

1　材料与方法

1.1材料人类肺泡Ⅱ型上皮细胞A549(美国ATCC公司),Trizol (Invivogen公司),重组人白介素-4(IL-4)细胞因子(PeproTech公司),重组人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)细胞因子(PeproTech公司),黄芪甲苷 (南京青泽有限公司),Anti-β-actin Ab(Abcam公司), IκBα抗体(Cell Signaling Technology 公司),NF-κB P65抗体(Abcam 公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及细胞因子刺激及药物干预: A549细胞接种于6孔培养板内培养,初始细胞接种密度为(2～5)×105/ml;当细胞进入对数生长期、细胞融合达80%～90%时,细胞分组: (1)正常对照组(Control组):不加任何细胞因子和药物;(2)IL-4+TNF-α组:IL-4(10 ng/ml)联合TNF-α(20 ng/ml)孵育0.5 h、1 h、4 h、10 h、18 h;(3)黄芪甲苷组(astragaloside Ⅳ):A549细胞与黄芪甲苷(100 μg/ml)单独孵育0.5 h、1 h、4 h;(4)IL-4+TNF-α+黄芪甲苷组:A549细胞与黄芪甲苷(100μg/ml)预先孵育0.5 h后,再与IL-4和TNF-α共同孵育0.5 h、1 h、4 h;(5)PDTC组:A549细胞+PDTC(20μg/ml)预先孵育0.5 h后,再与IL-4和TNF-α共同孵育4 h。

1.2.2实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法测A549细胞TSLP mRNA表达: 在4 h、10 h、18 h时间点,收集细胞检测TSLP mRNA表达情况。用紫外分光光度计分别测定样品在260 nm/280 nm比值及浓度,TSLP引物序列:sense:5’-TATGAGTGGGACCAAAAGTACCG-3’; antisense: 5’-TATGAGTGGGACCAAAAGTACCG-3’。作为内参照的β-actin引物序列,sense:5’-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3’;antisense:5’-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3’。结果分析使用相对的△CT表示;差别倍数=2-△△CT。

1.2.3western blot方法测定A549细胞 IκBα的蛋白表达:在0.5 h弃去培养液后,贴壁的细胞用PBS液洗2次,加入胰酶消化细胞后离心收集细胞提取胞浆和胞核蛋白, 按试剂盒说明书进行操作。

1.2.4免疫荧光检测NF-κB P65核转录情况:参照相关文献报道方法进行细胞免疫荧光染色[8];在1 h时间点收集A549细胞,用含4%多聚甲醛及0.03%TritonX-100室温固定30 min。固定后,10%羊血清PBS中37 ℃孵育1 h。用鼠抗人TSLP抗体或兔抗人p65抗体4 ℃孵育过夜。用FITC标记羊抗鼠IgG或Cy3标记羊抗兔IgG室温孵育2 h。置于DAPI染液中室温下复染8 min。漂洗过后自动荧光显微镜下观察并拍照,结果以NF-κB核阳性的细胞数与总细胞的相对百分比表示(每张切片计算100～200个总细胞)。

2　结果

2.1TNF-α联合IL-4对A549细胞TSLP mRNA表达的影响使用TNF-α联合IL-4刺激A549细胞,分别观察4 h、10 h和18 h时 TSLP mRNA的表达。在刺激4 h后,TSLP mRNA表达明显升高(P<0.05),在刺激10 h时,TSLP mRNA表达下降,到18 h基本下降至正常水平。见图1。

注:与其他时间点比较,*P<0.05图1　不同时间点细胞因子刺激对A549细胞TSLP mRNA表达的影响

2.2NF-κB抑制剂PDTC对A549细胞TSLP mRNA的表达影响孵育4 h时点，PDTC能够显著抑制TSLP mRNA的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注:与TNF-α+IL-4组比较,*P<0.05图2　NF-κB特异性抑制剂PDTC对A549细胞TSLP mRNA表达的影响

2.3黄芪甲苷对A549细胞TSLP mRNA的表达影响孵育4 h时点,黄芪甲苷不能抑制TSLP mRNA的表达(P>0.05)。见图3。

注:与对照组比较,*P<0.05;AST:黄芪甲苷图3　黄芪甲苷对A549细胞TSLP mRNA的表达影响

2.4黄芪甲苷对A549细胞胞浆IκBα蛋白和NF-κB核转录的影响A549细胞经TNF-α联合IL-4刺激0.5 h,IκBα蛋白表达降低,与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。黄芪甲苷干预后可以显著提高胞浆IκBα蛋白表达,与刺激组比较，差异有统计学意义(P<0.05),黄芪甲苷单独干预组与对照组比较，IκBα蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。A549细胞经TNF-α联合IL-4刺激1 h后,细胞核内NF-κB P65阳性细胞数的百分比与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05),黄芪甲苷干预后,NF-κB P65阳性细胞数的百分比显著降低,两者比较差异有统计学意义(P<0.05);见图5。

注:与TNF-α+IL-4组比较,*P<0.05;AST:黄芪甲苷图4　黄芪甲苷对A549细胞胞浆IκBα表达的影响

注:与TNF-α+IL-4+AST组比较,*P<0.05;AST:黄芪甲苷图5　黄芪甲苷对A549细胞NF-κB P65核转录的影响

3　讨论

支气管哮喘是多种炎症细胞及炎症因子参加的慢性气道炎症[9];长期以来一直认为气道上皮的功能仅限于通过纤毛摆动和黏液运输发挥防御作用,然而气道上皮细胞作为一种炎性细胞,可分泌多种炎性介质和细胞因子参与哮喘气道炎症和免疫反应,它和间质细胞相互作用参与哮喘气道重塑过程[1]。

TSLP的产生主要来源于气道上皮细胞,TSLP激活DCs促使机体Th2炎症的启动和发展,同时激活肥大细胞分泌IL-4、IL-5、IL-13等Th2型细胞因子,TSLP对于哮喘Th2气道炎症的形成具有关键性的作用[2-3, 7];而另一方面,Th2细胞因子IL-4、IL-13等可进一步促进气道上皮细胞分泌TSLP[4],该正反馈加重和扩大了哮喘气道炎症反应,因此打破该反馈，抑制气道上皮细胞TSLP的分泌对于哮喘的治疗具有重要的意义。在本实验中,使用TNF-α联合IL-4模拟哮喘Th2型微环境刺激A549细胞后,发现TSLP mRNA表达明显升高,尤其在4 h比较明显,使用NF-κB特异性抑制剂PDTC后，TSLP mRNA表达显著降低,说明在A549细胞,NF-κB通路对TSLP的表达具有重要的调控作用。

黄芪甲苷作为中药黄芪的主要标志成分,具有重要的抗炎、免疫调节等作用。既往研究表明在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)黄芪甲苷能够抑制TNF-α诱导的NF-κB P65的核转录和DNA结合力[5]。本实验中使用TNF-α联合IL-4激活A549细胞0.5 h后,胞浆IκBα的蛋白表达明显降低,在刺激1 h后胞核NF-κB p65免疫荧光阳性百分比增加,说明细胞因子刺激A549细胞后,胞浆IκBα降解,NF-κB P65核转录增强。黄芪甲苷干预0.5 h后IκBα的蛋白表达水平升高,细胞核内NF-κB P65阳性细胞数百分比减少,说明黄芪甲苷能够阻止胞浆IκBα的降解,抑制NF-κB P65核转录,提示黄芪甲苷具有抑制NF-κB通路的作用。

既往研究表明,糖皮质激素可以抑制TNF-α诱导的气道上皮细胞TSLP的表达[4],然而糖皮质激素并不能有效抑制TNF-α诱导的气道上皮细胞NF-κB P65核转录[8],其抑制TSLP的具体机制不明。在本实验中,我们观察黄芪甲苷对NF-κB调控的TSLP基因表达的影响,黄芪甲苷虽然能够抑制NF-κB P65核转录,但并不能降低TSLP mRNA的表达。推测其可能原因为:由于TSLP的调控涉及多种信号通路,如P38MAPK、细胞外信号调节激酶(ERK)、JAK-STAT等信号通路[10-11],黄芪甲苷可能作用于这些通路进而影响了TSLP mRNA的表达。黄芪甲苷对调控TSLP的其他通路的影响有待进一步研究。

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Effect of astragaloside Ⅳ on the expression of thymic stromal lymphopoietin in A549 cells

ZHUCheng-hua,DUQiang.

DepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210011,China

ObjectiveTo investigate the effect of astragaloside Ⅳ on the expression of TSLP mRNA in A549 cells, and to explore whether nuclear factor κB (NF-κB) is involved. MethodsA549 cells were cultured with TNF-α and IL-4, and the expression of TSLP mRNA at 4 h,10 h and 18 h was detected by real time-PCR. The effects of astragaloside Ⅳand PDTC (NF-κB inhibitor) on the expression of TSLP mRNA were also quantified by real time-PCR. The cytoplasm protein expression of IκBα was evaluated by western blot, and the nuclear translocation of NF-κB P65 was detected by immunofluorescence assays. ResultsCompared with the control group, the expression of TSLP mRNA was significantly increased in A549 cells stimulated with TNF-α and IL-4 at 4 h, and decreased at 10 h, almost reduced to the baseline at 18 h. PDTC greatly inhibited the level of TSLP mRNA. Astragaloside Ⅳ had little inhibitory effects on the expression of TSLP mRNA. However, Astragaloside Ⅳ suppressed the nuclear translocation of NF-κB P65, and enhanced the protein level of IκBα in the cytoplasm.ConclusionsNF-κB pathway may play an important role in regulating TNF-α and IL-4 stimulating TSLP mRNA expression. AstragalosideⅣ may suppress the nuclear translocation of NF-κB P65, enhancing the protein level of IκB-α in the cytoplasm. But, Astragaloside Ⅳ has little inhibitory effects on the expression of TSLP mRNA.

nuclear factor κB; thymic stromal lymphopoietin; astragaloside Ⅳ

南京医科大学科学发展基金(2013NJMU049)

210011江苏省南京市,南京医科大学第二附属医院呼吸科

杜强，Email:Jingshuyue@163.com

R 446.63

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2016.10.019

2015-10-19)