红葡萄酒、桃红葡萄酒和白葡萄酒的抗氧化活性比较*

高　原，王福玲，贾　琦，刘　微，周艳岩

（哈尔滨商业大学 药学院 细胞与分子生物学研究所，黑龙江 哈尔滨150076）

工程师园地

红葡萄酒、桃红葡萄酒和白葡萄酒的抗氧化活性比较*

高原*，王福玲，贾琦，刘微，周艳岩

（哈尔滨商业大学 药学院 细胞与分子生物学研究所，黑龙江 哈尔滨150076）

本文比较了红葡萄酒、桃红葡萄酒和白葡萄酒的总酚含量及抗氧化活性差异。通过比较红葡萄酒、桃红葡萄酒和白葡萄酒的总酚含量、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力、Fe3+总抗氧化能力（FRAP）、铁还原能力、清除羟基自由基能力等试验，评价不同种类葡萄酒的抗氧化活性。实验结果表明，红葡萄酒总酚含量最高，达到GAE 2120mg·L-1。其中红葡萄酒的DPPH自由基清除试验、铁还原能力试验、清除羟基自由基能力试验的半数抑制浓度（IC50）值所对应的葡萄酒稀释倍数分别为：0.046、0.033和0.13，Fe3+总抗氧化能力（FRAP）试验结果为449.57μmol·L-1FeSO4。红葡萄酒、桃红葡萄酒和白葡萄酒均具有一定的抗氧化活性，活性强弱依次为红葡萄酒＞桃红葡萄酒＞白葡萄酒。

葡萄酒；总酚；抗氧化；自由基；还原能力

葡萄酒是以葡萄或葡萄汁为原料经发酵酿制而成含有酒精的饮料，它含有花青素、儿茶素、表儿茶素、没食子酸、山奈酚、白藜芦醇等多酚类抗氧化活性物质［1］。从化学结构上讲，多酚物质是含有酚羟基的物质，在苯环上联有一个或多个羟基的化合物。这类物质决定了葡萄酒的感官特征和质量指标，如葡萄酒的颜色、口感、香气、骨架和结构等。适量饮用葡萄酒具有防治心脑血管疾病、抗动脉粥样硬化、抗氧化、抗肿瘤、抗炎症、预防老年痴呆症等多种保健功能。

氧自由基（ROO·、O～·）和羟自由基（OH-）能引起生物膜过氧化作用而导致细胞结构和功能损伤，多酚类物质可通过与羟基所提供的氢自由基（H·）的结合而消除自由基，从而保护细胞组织免受氧化作用的损害［2］。自由基和脂质过氧化损伤是动脉粥样硬化、癌症、肝病和老化的主要因素。葡萄酒中的多酚类化合物对一些严重危害人体健康的疾病如肥胖、心脏病、癌症等都具有一定的治疗或预防作用［3］。

本文通过对红葡萄酒、桃红葡萄酒和白葡萄酒的总酚含量测定、DPPH清除自由基实验、Fe3+总抗氧化能力实验、铁还原能力实验、清除羟基自由基能力等实验综合比较了3种葡萄酒的抗氧化活性。

1　实验部分

1.1材料与试剂

葡萄酒（京东商城澳洲奔富洛神山庄），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（Ruitaibio），2，4，6-三吡啶基 -1，3，5-三嗪 （TPTZ）（MYM Biological Technology）；生育酚 Trolox（Sigma），维生素 C（Sigma），福林-酚试剂（天津市光复精细化工研究所）；三氯乙酸（国药集团化学试剂有限公司）；醋酸钠（天津市福晨化学试剂厂），HAc（西陇化工股份有限公司）；FeSO4（西陇化工股份有限公司），KCN（西陇化工股份有限公司），FeCl3（西陇化工股份有限公司）；水杨酸（西陇化工股份有限公司），甲醇（天津市天力化学试剂有限公司），乙醇（天津市天力化学试剂有限公司），H2O2（天津市风船化学试剂有限公司），以上试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

BSA223S-CW型分析天平（上海精天电子仪器公司）；HH-ZK型二孔多能水浴锅（郑州英裕予华仪器有限公司）；T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.3方法

1.3.1总酚含量的测定总酚含量的测定采用Folin-酚比色法［4］。

1.3.2DPPH清除自由基实验精密称取DPPH 4.0mg，用无水乙醇溶解并定容至10mL中，得浓度为0.04%的DPPH贮存溶液，避光保存，备用。使用时将DPPH贮存液进行10倍稀释，得到浓度为0.004%DPPH溶液。分别取稀释不同稀释倍数的葡萄酒溶液（1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125）100μL，置4mL离心管中，加入1.4mL无水乙醇，1.0mL的DPPH溶液，室温避光反应70min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值；以1.5mL无水乙醇加1mL DPPH为对照。按下列公式计算DPPH自由基清除率。用无水乙醇做空白对照［5］。

清除率Ai=（Ac-Ao）Ac×100%

式中Ac：1.5mL无水乙醇+1mL DPPH；Ao：100μL样品+1.4mL无水乙醇+1mLDPPH

1.3.3Fe3+总抗氧化能力（FRAP法） 取0.3mol·L-1醋酸盐缓冲液（NaAc-HAc pH=3.6）25mL，加入2.5mL经过十倍稀释的10mmol·L-1TPTZ（溶解于40mmol·L-1盐酸），最后加入 20mmol·L-1FeCl32.5mL，混合均与即为FRAP工作液。取300μL不同稀释浓度的葡萄酒样品（1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125）与2.7mL FRAP工作液混合，在37℃恒温水浴锅中保温30min，593nm测吸光度。将300μL无水乙醇和2.7mL FRAP工作液的混合液作对照。空白是无水乙醇［6］。

同时进行FeSO4标准曲线的绘制，以1μmol·L-1FeSO4为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO4的微摩尔数表示。

1.3.4铁还原能力实验取不同稀释浓度的葡萄酒样品，分别为1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125的样品0.35mL，加入相应体积的的PBS（625mL 0.2 mol·mL-1Na2HPO4及375mL 0.2mol NaH2PO4混合，pH=6.6）及1%的铁氰化钾（K3［Fe（CN）6］），混合均匀后在50℃中水浴20min后冷却至室温，再加入0.35mL 10%三氯乙酸，在3000rpm下离心10min，取上清液1.2mL，分别加1.2mL蒸馏水和0.24mL 0.1% FeCl3，室温静置10min，在700nm下测OD。以Trolox作为阳性对照。阴性对照中以水为代替，其余与待测样品步骤相同［7］。

1.3.5清除羟基自由基能力的测定取稀释浓度分别1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125的葡萄酒样品1mL，9mmol·L-1FeSO4溶液1mL，9mmol·L-1水杨酸乙醇溶液1mL、8.8mmol·L-1H2O2溶液1mL。摇匀，37℃保存30min。在3000rpm下离心10min，取上清液，以水为参比液于510nm处测光密度Ax；每管中加入与待测液浓度及体积相同的待测液，其余试剂用水代替，测得本底光密度Axo；Trolox作为阳性对照，阴性对照以水代替测得阴性对照光密度A0［8］。按下式计算清除率：

清除率（%）S=［1-（Ax-Axo）/A0］×100%

式中Ax：加入水解液后的吸光度值；Axo：水解液本底吸光度值；A0：空白对照液吸光度值。

1.3.6统计学处理及方法应用SPSS统计软件包进行数据统计学处理。采用ANOVA方差分析并行方差齐性检验；结果以X±S表示。

2　结果与讨论

2.1总酚含量的测定

葡萄酒中的酚类物质具有较强的抗氧化活性和清除自由基的能力，对人体有很好的保健作用，因此，葡萄酒的抗氧化活性可以作为评价葡萄酒质量高低的一个指标，含有酚类物质是酒精性饮料具有抗氧化化功能的主要原因之一［9］。通过对红葡萄酒、桃红葡萄酒及白葡萄酒中总酚含量的测定结果进行比较，见图1，我们发现红葡萄酒中的总酚含量最高，与桃红葡萄酒和白葡萄酒存在显著性差异，达到2120mg·L-1，其次是桃红葡萄酒，含量为1255mg·L-1，白葡萄酒的含量最低，约为290mg·L-1。

图1　葡萄酒中总酚含量的测定Fig.1　Total phenol content in wine

2.2DPPH清除自由基实验

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基是一种稳定的有机自由基，常用来评价抗氧化物质的体外抗氧化能力。其能力用清除率来表示，清除率越大，其抗氧化能力越强［10］。DPPH清除自由基实验测定结果见图2，当红葡萄酒、桃红葡萄酒及白葡萄酒的IC50值分别为0.046，0.17和0.29，即当红葡萄酒、桃红葡萄酒及白葡萄酒分别稀释至0.046，0.17和0.29时，DPPH清除率达到50%。葡萄酒具有较好的清除自由基能力，且红葡萄酒的清除自由基能力最强。阳性对照维生素C的DPPH清除自由基实验其IC50值为0.711μg·mL-1。

图2　DPPH清除自由基实验Fig.2　DPPH radical scavenging assay

2.3Fe3+总抗氧化能力（FRAP法）

Fe3+总抗氧化能力（FRAP）实验利用Fe3+被还原成Fe2+，从而使其与三吡啶三吖嗪（TPTZ）形成的复合物在593nm下吸光度发生变化这一原理来测定样品的抗氧化活性。而且该方法不是针对某一种特定自由基的清除能力测定，而是反应样品的总抗氧化能力。葡萄酒稀释液通过FRAP总抗氧化能力实验的测定，表明3种葡萄酒具有均具有较强的抗氧化能力，通过绘制FeSO4标准曲线，得到回归方程：y=0.0023x+0.193（R2=0.9991）。以1μmol·L-1FeSO4为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO4的微摩尔数表示。实验结果见图3，当葡萄酒稀释倍数为1时，红葡萄酒、桃红葡萄酒和白葡萄酒的总抗氧化能力为分别为 449.57、380.25和264.05μMFeSO4。阳性对照维生素C的FRAP值为11.38mMFeSO4。

图3　总抗氧化能力实验Fig.3　Ferric ion total antioxidant power assay

2.4铁还原能力实验

在铁还原能力实验中，抗氧化剂通过自身的还原作用给出电子而清除自由基。样品中的抗氧化剂可使铁氰化钾（K3［Fe（CN）6］）的Fe3+被还原成Fe2+，与氯化铁生成普鲁士兰（Fe4［Fe（CN）6］3），在700nm处有最大吸光度，因此，可通过测定还原力来说明其抗氧化活性的大小，还原力越强，抗氧化性越强。经实验测得3种葡萄酒均具有一定的铁还原能力，红葡萄酒、桃红葡萄酒和白葡萄酒的IC50值分别为0.033、0.085和0.17，表示在吸光度值为0.5时红葡萄酒、桃红葡萄酒和白葡萄酒的稀释浓度为0.033、0.085和0.17。

见图4。阳性对照生育酚（Trolox）的IC50值为0.9600μg·mL-1。

图4　铁还原能力实验Fig.4　Reducing power assay

2.5清除羟基自由基能力的测定

羟自由基是活性氧中对生物体危害最大的一种自由基，可造成生物体内的氨基酸、糖类、核酸及脂类等大分子物质发生氧化损伤，使其失去正常的生理功能。水杨酸可以捕获羟基自由基生成2，3-二羟基苯甲酸和2，5-二羟基苯甲酸，在波长510nm处有最大吸收值。基于以上原理可间接反应样品清除羟基自由基能力。羟基自由基清除率实验结果见图5。

图5　羟自由基清除实验Fig.5　Hydroxyl radical scavenging assay

由图5检测结果可计算得，红葡萄酒、桃红葡萄酒和白葡萄酒的 IC50值分别为 0.13、0.19和0.26，表示在清除率为50.00%时，红葡萄酒、桃红葡萄酒和白葡萄酒的稀释浓度分别为0.13、0.19和0.26。阳性对照生育酚（Trolox）的羟自由基清除能力IC50值为0.0220mg·mL-1。

3　结论

红葡萄酒、桃红葡萄酒和白葡萄酒在成分含量上有所区别。其中不同颜色的葡萄酒中多酚含量不同，其抗氧化活性也有所差别。葡萄酒中的酚类物质具有较强的抗氧化性和清除自由基的能力，对人体有很好的保健作用，因此，葡萄酒的抗氧化活性可以作为评价葡萄酒质量高低的一个指标。

本研究通过比较红葡萄酒、白葡萄酒、桃红葡萄酒的总酚含量及抗氧化活性的差异，并通过多种方法对3种葡萄酒的抗氧化功能进行了综合性的评价。结果表明，红葡萄酒、桃红葡萄酒和白葡萄酒对DPPH自由基、羟基自由基均具有清除和抑制作用。FRAP实验和铁还原能力实验表明3种葡萄酒均具有抗氧化能力及还原能力。综合评价可知，红葡萄酒抗氧化能力最强，白葡萄酒最弱。

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Antioxidant activity difference in red wine，rose wine and white wine research*

GAO Yuan ，WANG Fu-ling，JIA Qi，LIU Wei，ZHOU Yan-yan
（College of pharmacy，Cell and molecular biology research institute，Harbin commercial university，Harbin 150076，China）

In this study antioxidant activity of wines was evaluated by comparing the red wine，rose wine and white wine，including the total phenol content，1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）radical scavenging capacity，ferric iron ion total antioxidant capacity（FRAP），reducing power assay and hydroxyl radical scavenging assay. The results showed that the red wine has the highest total phenol content which was Gallic acid（GAE）2120mg· L-1.Red wine has better antioxidant activity than rose wine and white wine，the IC50value was 0.046、0.033 and 0.13 dilution ratio wine in DPPH radical scavenging assay，iron reducing power experimental and hydroxyl radical scavenging assay，respectively，results of ferric iron ion total antioxidant capacity was 449.57μM FeSO4.Red wine，rose wine and white wine has a certain antioxidant activity，and the antioxidant power was that red wine was greater than rose wine，rose wine was greater than white wine.

wine；total phenol；antioxidant；free radicals；reducing power

TS262

A

2016-06-16

黑龙江省教育厅科学技术研究项目（12541204）资助

高原（1983-），女，博士，讲师，2012年毕业于东北林业大学植物学专业，研究方向：抗氧化活性作用机制。