Reprimo基因3'非翻译区839位点多态性与肺癌发生的关联*

陈贤华，胡宏波，冯金，孙秀娟，刘大鹰

（广西省柳州市柳铁中心医院1.检验科，2.病理科，3.呼吸内科，广西 柳州 545007）

Reprimo基因3'非翻译区839位点多态性与肺癌发生的关联*

陈贤华1，胡宏波1，冯金1，孙秀娟2，刘大鹰3

（广西省柳州市柳铁中心医院1.检验科，2.病理科，3.呼吸内科，广西 柳州 545007）

目的探讨R eprimo基因3'非翻译区839位点单核苷酸多态性改变与肺癌发生的关系。方法基因分型用TAKAR A的MightyAmp DNA聚合酶法，分别检测36例肺癌患者（癌症组）和23例非癌患者（对照组）的R eprimo基因3'非翻译区839位点G>C分布，运用χ2检验、Logistic回归分析和Armitage's趋势检验等分析基因多态性、患者性别、吸烟与否和年龄与肺癌发生的相关性。结果两组标本经Hardy-Weinberg平衡检测，对照组在R eprimo基因3'非翻译区839位点G>C基因型观测(理论)频数为0，22，1（5.26，11.48，6.26），差异有统计学意义（P=0.000）,癌症组的基因型观测(理论)频数为6，29，1(11.67，17.65，6.67)，差异有统计学意义（P=0.000）；经Logistic回归分析，基因多态性、年龄是危险因素，基因多态性、年龄和吸烟与否在肺癌发生中不存在交互作用（P>0.05）；经Armitage's趋势检验差异无统计学意义（χ2=3.56，P=0.059）。结论R eprimo基因3'非翻译区839位点G>C单核苷酸位点多态性与肺癌发生具有一定的相关性。

肺癌；R eprimo；多态性；哈迪一温伯格平衡

1 材料和方法

1.1临床资料

36例肺癌和23例非癌对照组病例选自2006年1月-2012年12月广西省柳州市柳铁中心医院和外院手术切除或纤维支气管镜取得的肺（癌）组织，质地良好，10%中性福尔马林立即固定，石蜡包埋处理，室温存档至今；非癌对照组病例为肺支扩、肺扩张、非典型增生患者。

1.2提取DNA方法

选取TaKaRa DEXPAT试剂。肺（癌）组织加进PE管（切片厚度为5μm），0.3 ml TaKaRa DEXPAT提取液，恒温加热仪100℃加热10 min，低温离心机12 000 rpm，4℃离心10 min形成分液层，吸取水层就可得到PCR扩增用DNA。具体操作请参考说明书。

1.3扩增仪器和试剂

扩增仪器：伯乐MJ Mini扩增仪，试剂为TAKARA的MightyAmp DNA Polymerase试剂盒，正反向引物由上海生工合成,碱基序列为R1：5'-GCGCAGAACTTTGGAAGCTGC-3'；R2：5'-GCGC AGAACTTTGGAAGCTGG-3',R3：5'-AGGAGAAGAG TGGGAGCGC-3；R1R3针对839位点的G片段，扩增235bp产物；R2R3针对839位点的C片段，扩增235bp产物。

1.4PCR反应体系

有了第二个角的测量经验，对于第三个角，学生想到把45°的角再折小点，经过几番尝试，发现把45°角进行三等分，每个角为15°，再用自制的量角工具进行第三次量角，得出待测角与正方形里的15°角的两边刚好重合，是15°。

反应体系为25μl:2×PCR Buffer 12.5μl，正向引物0.5μl，反向引物0.5μl，模板DNA 4μl，重蒸水7μl，酶（5 u/μl）0.5μl。反应条件：98℃预变性5min，扩增温度98℃10 s、60℃15 s、68℃60 s，扩增循环40次，最后68℃延伸4 min；PCR扩增目的基因DNA的检测：取10μl PCR产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳。

1.5统计学方法

采用SPSS 15.0统计软件进行数据分析，χ2检验评估对照组和病例组中各基因型的分布差异，t检验评估年龄组差异，Logistic回归分析多因素关系，以P=0.05为检验水准；哈迪一温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）检测、Armitage's趋势检验、计算比值比（OR）及95%可信区间（CI），利用在线软件（http://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl）进行计算，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1研究对象基本资料

收集肺癌患者36例。病理分组：小细胞癌组10例，大细胞癌组10例，腺癌组9例，鳞癌组7例；男性26例，平均（58.81±10.42）岁，女性10例，平均（54.40±9.58）岁，年龄差异无统计学意义（t=1.161，P=0.254）。23例非癌对照患者，男性19例，平均（54.21±10.24）岁，女性4例，平均（50.00±6.16）岁，年龄差异无统计学意义（t=0.784，P=0.442）。

2.2Reprimo基因分型和电泳

Reprimo基因3'非翻译区839位点各个基因型在琼脂糖凝胶电泳显示的条带可为GG：235 bp；CC：235 bp；GC：235 bp。见附图。

附图　Reprimo基因3'非翻译区839 G>C位点基因型条带图谱

2.3Hardy-Weinberg平衡检验

各组在Reprimo基因3'非翻译区839G>C位点基因型频数（观测/理论）GG，GC，CC和Hardy-Weinberg检验具体见表1，判断其符合Hardy-Weinberg平衡的标准为P>0.05。

表1　各组研究对象Hardy-Weinberg平衡检测

2.4基因多态性、患者性别、吸烟与否和年龄对肺癌发生的影响

2.4.1单因素分析基因多态性与肺癌与否关系的χ2检验（χ2=6.394，P=0.041）；性别与肺癌与否关系的χ2检验（χ2=0.837，P=0.360）；吸烟与否与肺癌与否关系的χ2检验（χ2=1.639，P=0.200）；年龄与肺癌与否关系的χ2检验（χ2=1.532，P=0.131），P<0.05为差异有统计学意义。

2.4.2多因素Logistic回归分析以基因多态性、吸烟与否和年龄为3个自变量，肺癌与否为因变量做Logistic回归分析，B为回归系数，Exp（B）为相对危险度，以P<0.05为差异有统计学意义。见表2。

表2　多因素Logistic回归分析

2.5Reprimo 839位点多态性与各组肺癌易感性的Armitage's趋势检验

携带C等位基因的患者比G等位基因的患者肺癌发病率低；携带GC、CC及GC+CC基因型的患者比GG基因型的患者肺癌发病率更低，各肺癌组Armitage's趋势检验情况具体见表3。

表3　各组肺癌Reprimo 839位点各基因模型Armitage's趋势检验

3 讨论

基因Reprimo是细胞周期调控蛋白，含有109个氨基酸，相对分子量为12 kD，定位于人类染色体2q23；是P53基因的下游靶基因，异位表达的P53可引起ReprimomRNA表达，其过表达可使细胞生长停滞于G2期其机制可能是通过抑制Cdc2/cyclinB1和Cdc2活性核转位的途径来调节细胞周期[6]。

现报道Reprimo基因甲基化与肿瘤关系的论文很多，认为其与肿瘤是否发生、治疗方面存在一定的相关性[7-9]，而Reprimo基因多态性与肿瘤研究的报道较少，YE等在实验中发现Reprimo基因3'非翻译区的824位点存在G>C多态性，经Hardy-weinberg平衡检验高加索人群，证明该位点基因型和等位基因频率分布均符合遗传平衡规律[10]。BEASLEY等[11]在研究Reprimo基因3'非翻译区824位点G>C多态性与大肠癌的关系时，健康组和大肠癌组也证实在该位点符合遗传平衡规律，但憩室病组不符合此平衡规律。

本研究发现，肺癌组和非癌对照组在Reprimo基因3'非翻译区839位点基因型和等位基因频率分布不符合遗传平衡状态（P<0.05），但是肺癌病理分组中大细胞癌组、腺癌组、鳞癌组符合该规律（P>0.05）；小细胞癌组可认为接近符合遗传平衡状态（P=0.045）。各肺癌组之间的基因型差异无统计学意义（χ2=4.287，P=0.638）。不符合Hardy-weinberg平衡的原因可能是基因分型错误，也可能是基因缺失/突变，也可能是样品数不足够大。

在相同致癌条件下，暴露人群只有一部分人会得肺癌，病因学研究表明不同个体对致癌物的易感性是有差异性的；分子流行病学提示遗传倾向对大多数肺癌可能起到关键性作用[12]。本研究结果发现：基因多态性、患者性别、吸烟与否、年龄与肺癌发生与否作单因素分析时，基因多态性、年龄对肺癌发生与否有统计学意义（P<0.05），患者性别、吸烟与否对肺癌发生与否无统计学意义（P>0.05）。因吸烟为肺癌的传统危险因素，因此以基因多态性、吸烟与否和年龄为3个自变量，以肺癌与否为因变量做Logistic回归分析，3者在肺癌发生中不存在交互作用（P>0.05），但基因多态性相对危险度最高，Exp（B）=5.369，说明基因多态性在肺癌发生中起了重要作用。

BEASLEY等[11]研究Reprimo基因3'非翻译区824位点G>C多态性与大肠癌的关系时，报道Reprimo基因824位点G>C多态性与大肠癌不存在相关性。本实验结果显示Reprimo基因3'非翻译区839位点基因改变，携带C等位基因的患者比G等位基因的患者肺癌发病率低；携带GC、CC及GC+CC基因型的患者比GG基因型的患者肺癌发病率也明显降低，Armitage's趋势检验差异无统计学意义（P>0.05），说明Reprimo基因3'非翻译区839位点基因改变，肺癌发生趋势不是线性增加，但此处P=0.059，很接近0.05，可认为基因多态性与肺癌发生还是具有一定相关性的，且在肺癌病理分组中大细胞癌、鳞癌与基因多态性存在相关性（P<0.05），腺癌、小细胞癌与基因多态性不存在相关性（P> 0.05）。

综上所述Reprimo基因3'非翻译区839位点多态性与肺癌的发生具有一定相关性，尤其是携带G等位基因、GG基因型的患者更有可能发展成肺癌；基因多态性、患者性别、吸烟与否和年龄在肺癌发生中不存在交互作用，基因多态性相对危险度最高。由于本实验样本含量有限，且该位点基因不能解释Reprimo基因所有位点的功能特性，在后续研究中有必要进一步扩大样本含量和实验，以期明确Reprimo基因单核苷酸多态性改变、基因类型与肺癌发生发展中关联。

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（张蕾编辑）

Study of Reprimo 839 G＞C polymorphism and relationship with lung cancer*

Xian-huaChen1,Hong-boHu1,JinFeng1,Xiu-juanSun2,Da-yingLiu3
（1.Clinical laboratory，2.Pathology department，3.Respiratory medicine，Liuzhou Municipal Liutie Central Hospital，Liuzhou，Guangxi 545007，China）

Objective To investigate the relationship between theReprimogene 3'-untranslated region 839 polymorphism and lung cancer.Methods Genotyping was performed with MightyAmp DNA Polymerase，a number of 36 lung cancer cases and 23 control cases were genotyped.The results of investigation were analyzed with χ2test，Logistic regression analysis and Armitage's trend test.Results According to Hardy-Weinberg equilibrium detection，Reprimo839 G＞C genotype observation（theory）frequency was 0，22，1（5.26，11.48，6.26）in the control group（with statistically significant difference，P=0.000）and 6，29，1（11.67，17.65，6.67）in the cancer group（with statistically significant difference，P=0.000）.Analyzed by Logistic regression analysis，gene polymorphism and age were risk factors，and there were no possible interactions among gene polymorphism，age，smoking status and lung cancer（P＞0.05）.Armitage's trend test revealed no statistically significant correlation between 839 G＞C polymorphism and susceptibility to lung cancer（χ2=3.56，P=0.059）.Conclusions This study indicates that there is a correlation between theReprimogene 3'-untranslated region 839 G＞C polymorphism and lung cancer.

lung cancer；reprimo；polymorphism；hardy-weinberg equilibrium

R 734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.20.004

1005-8982（2016）20-0016-05

2016-02-23

柳州市科学技术局技术研究与开发计划课题（No：2011J0302031）；广西卫生厅计划课题（No：Z2010138）