未见原核和单原核受精卵来源囊胚解冻移植的临床研究*

伍玲园，黄华，莫似恩，陈自洪，阮秋燕，孙燕萍，乃东红，牛向丽

（广西壮族自治区卫生计生委生殖中心生殖科，广西 南宁 530021）

临床报道

未见原核和单原核受精卵来源囊胚解冻移植的临床研究*

伍玲园，黄华，莫似恩，陈自洪，阮秋燕，孙燕萍，乃东红，牛向丽

（广西壮族自治区卫生计生委生殖中心生殖科，广西 南宁 530021）

目的探讨受精卵在观察原核时期消失，以及部分消失单原核受精卵最终发育成囊胚的临床应用价值。方法选取2013年1月-2015年7月于该中心进行体外受精-胚胎移植治疗的19例患者，其中未见原核（0PN）而最终发育成囊胚进行冻融移植患者17例，单原核受精卵（1PN）最终发育成囊胚进行冻融移植患者2例，解冻后观察胚胎的复苏质量，移植后对患者的临床妊娠情况进行随访。结果17例0PN来源囊胚的解冻移植周期中临床妊娠6例，其中4例足月活产（3男1女），1例早停育，1例早期流产；解冻1PN囊胚的2例临床随访结果阴性。结论0PN来源的囊胚解冻移植可获得一定的临床妊娠率，在无双原核受精卵来源胚胎下，可作为正常胚胎移植。

未见原核；单原核受精卵；囊胚；解冻移植；妊娠

辅助生殖技术给广大不孕夫妇带来新的希望，从技术上解决不孕、不育等长期困扰医学界的难题，纠正病理的生殖状态，延续生殖过程。在体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）治疗过程中，成熟卵母细胞完成第2次成熟分裂并与精子融合形成受精卵。目前，评估受精的方法主要是根据在适当时机观察第二极体的排出和原核情况。正常受精卵有2个原核（2 pronucleus，2PN），由于原核的不同步发育，使单一时间的观察不完全准确，这并不一定提示受精失败[1]。继续培养未见原核（non-pronuclcus，0PN）和单原核受精卵（onepronuclcus，1PN）受精卵可发生卵裂甚至发育成囊胚，这两种来源的胚胎能否使用，一直困扰着胚胎学家们。本研究通过延长体外培养时间，筛选出发育潜能良好的囊胚，进行玻璃化冷冻保存，对0PN和1PN来源的囊胚进行解冻移植，随访其临床妊娠结局并分析移植价值。

1 资料与方法

1.1研究对象

选取2013年1月-2015年7月于本中心行0PN和1PN来源囊胚冻融移植的患者，男性精液未见异常，来源为体外受精（in vitro fertilization，IVF）；其中解冻移植0PN来源囊胚17例，年龄24～45岁,平均（33.29±4.79）岁；不孕年限1～11年，平均（4.65± 3.04）年；原发不孕4例，继发不孕13例；解冻移植1PN来源囊胚2例，年龄30～35岁，不孕年限3～5年，原发不孕1例，继发不孕1例。

1.2实验方法

1.2.1原核观察和囊胚期胚胎评估原核的观察通常是在常规IVF或卵胞浆内单精子显微注射技术（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）授精后16～20h进行，倒置显微镜下观察原核的形态和数量。正常受精卵可观察到2PN，只有1个原核的为1PN受精，未观察到原核而发育成胚胎的为0PN，≥3个原核的为多PN受精。培养至第5或6天进行囊胚评估，根据囊胚腔的大小和是否孵化，将囊胚的发育分为1～6个时期，又根据3～6期囊胚内细胞团质量分为A、B、C 3级，3～6期囊胚的滋养层细胞分为A、B、C 3级[2]；根据评级挑选适合冷冻或移植的囊胚，冷冻的囊胚解冻后进行移植。

1.2.2囊胚的冷冻和复苏本中心采用玻璃化冷冻方法，将可冷冻的囊胚置于玻璃化平衡液（equilibrium solution，ES）液滴12～15 min，随后移入玻璃化冷冻液（vitrification solution，VS）液滴中，从VS液滴进入液氮的操作过程<1min，操作在室温下进行。复苏方法依照玻璃化解冻复苏方法进行，置入解冻液1号液（warming solution，WS1）中1min，随后置入2号液中（WS2）3min，再转入3号液中（WS3）5 min，转入4号液中（WS4）5 min后转入囊胚培养皿中培养待移植。玻璃化冷冻液和解冻液采用日本Kitazato公司加藤系列。

1.2.3临床妊娠的确认胚胎移植后14 d抽血验人绒毛膜促性腺激素，阳性者继续黄体支持，14d后B超见孕囊及胎心搏动者确定为临床妊娠，未见者为生化妊娠。

2 结果

2.1实验室结果

解冻0PN来源囊胚移植的17例，总共获卵数212枚，平均（12.47±5.29）枚；成熟卵子数184枚，卵子成熟率为86.79%，0PN胚胎数68枚，形成可用囊胚数39枚，可用囊胚形成率为57.35%。解冻1PN来源囊胚移植的2例，共获卵数31枚，平均（15.5± 4.5）枚，成熟卵子数25枚，卵子成熟率为80.65%，0PN胚胎数3枚，形成可利用囊胚数2枚。

2.2临床随访结果

对0PN来源囊胚解冻移植的17例进行随访，临床妊娠6例中有4例足月活产（1例双胎减1胎刨1女，3例刨1男，活产婴儿体检均健康），1例早期流产，1例生化妊娠，其他11例检查阴性。1PN来源囊胚解冻移植2例，2例随访均为阴性。见表1、2。

表1　0PN来源胚胎解冻临床随访结果

表2　1PN来源胚胎解冻临床随访结果

3 讨论

受精是精子与卵子结合的一系列复杂过程，以核膜重新形成，并包绕精源和卵源染色质形成精原核和卵原核为结束标志[3]。正常受精卵在授精6～20h后可观察到2个清晰的原核，而由于受临床工作时间安排限制，本中心一般是授精后16～20 h观察原核，雌雄原核发育不同步使单一时间观察并不完全准确[4]，会有0PN和1PN胚胎发生。有研究报道，一些通过光学显微镜观察认为异常的受精卵，经细胞分子生物学方法证实是正常的二倍体[5]。马水英等[6]也报道，通过延长体外培养的时间，逐渐筛选掉非二倍体胚胎，可增加正常胚胎的比例。本研究中17例解冻复苏移植0PN来源囊胚最后获得6例临床妊娠，其中1例停育，1例早期流产，其他已出生的4个婴儿均健康，也说明部分0PN来源胚胎是正常2倍体，可获得一定的妊娠率和出生率。目前，受精的评估主要根据在适当时间观察第二极体和原核情况决定。受精是一个过程，出现第二极体可以作为早期判断受精的征象，IVF-ET中受精的最终判断是通过授精后的原核情况判断。0PN发生的原因可能是观察时间不对，雌雄原核过早融合，导致原核消失或尚未形成，这并不一定提示受精失败。梁明明等[7]报道，早期原核消失是预测胚胎发育潜能和临床妊娠结局的一个有意义的指标。另外有研究指出，胚胎的发育至融合阶段形成囊胚，胚胎基因组激活，并决定胚胎的进一步发育，能发育到囊胚阶段的胚胎其染色体异常率低[8]。所以在不确定0PN胚胎是否为正常受精胚胎的情况下，医师可以通过延长体外培养时间至发育到囊胚阶段，自然筛选出正常或者最接近正常的胚胎，可提高胚胎的利用率；在选择胚胎移植的时候，充分告知并征得患者同意的情况下，0PN来源囊胚可作为正常胚胎实施单囊胚移植，以便于患者接受产前检查。

体外受精过程中，1PN的发生率为3%～6%。其产生机制可能有以下几点：①孤雌或孤雄原核的发生；②卵母细胞的孤雌激活；③雌雄原核融合；④雌雄原核不同步发育导致单一时间内仅观察到1个原核。而由于光学显微镜不能判断1PN胚胎是来源于雌雄原核发育不同步或是异常受精，且多数1PN胚胎存在染色体异常，易发育停滞导致囊胚形成率低，故而认为其不具有移植价值。一些学者对IVF来源和ICSI来源的1PN胚胎进行细胞遗传学研究对比，发现IVF来源的1PN胚胎的正常二倍体率显著高于ICSI来源[9]。本研究选取的胚胎均为IVF来源。有报道通过移植1PN胚胎获得健康出生婴儿，认为可以通过囊胚培养的方法对其进行发育潜能的筛选，增加临床移植应用的机会[10]。目前对于1PN胚胎的研究尚缺乏大样本量的数据统计，本研究仅有2例1PN来源囊胚应用解冻移植，且未获得临床妊娠结果，关于1PN来源囊胚是否可用于移植还存在争议，有待进一步探索研究。

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（童颖丹编辑）

R 714.8

B

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.028

1005-8982（2016）19-0132-03

2016-03-01

广西壮族自治区人口和计划生育委员会科研项目（No：桂人口计生研1102、桂人口计生研1109、桂人口计生研1305）

牛向丽，E-mail：59075287@qq.com