适宜母猪配合饲料发酵的菌种筛选及其发酵条件的优化研究

谢全喜，亓秀晔，陈振，于佳民，徐辉，徐海燕，林显华，谷巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000）

适宜母猪配合饲料发酵的菌种筛选及其发酵条件的优化研究

谢全喜*，亓秀晔，陈振，于佳民，徐辉，徐海燕，林显华，谷巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000）

通过测定发酵饲料pH值、活菌数、粗蛋白质和总酸含量，筛选出适宜妊娠母猪配合饲料发酵的鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）BLCC2-0038和产朊假丝酵母（Candida utilis）BLCC4-0021，并对筛选出的鼠李糖乳杆菌和产朊假丝酵母复配发酵工艺进行了优化。结果表明，BLCC2-0038单独发酵48 h时pH值降至3.88，活菌数为69.5×108cfu/g，总酸含量高达27.38 mg/g；BLCC4-0021单独发酵48 h时活菌数为544.0×107cfu/g，粗蛋白质含量高出对照11.32%。最佳的混菌接种组合为BLCC2-0038∶BLCC4-0021=1.5%∶0.5%。使用最佳的菌种组合发酵妊娠母猪配合饲料的最佳工艺条件为：料水比1∶0.6、温度28℃、发酵时间48 h，在此条件下乳酸杆菌活菌数为109.0×108cfu/g，酵母菌活菌数为46×106cfu/g和总酸含量为14.71 mg/g。

妊娠母猪；配合饲料；发酵；鼠李糖乳杆菌；产朊假丝酵母；活菌数；粗蛋白质；总酸含量

微生物发酵饲料是指在人为可控制的条件下，以植物性农副产品为主要原料，利用乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌等有益微生物对一种或多种饲料原料进行厌氧或好氧发酵，达到提高饲料原料营养物质利用率，消除抗营养因子，同时有益微生物大量繁殖、富集，功能性初级、次级代谢产物大量生成的一种新型发酵生物饲料（林标声等，2015）。乳酸菌是应用最早、最广泛的益生菌，具有益生菌的效用，可维持肠道菌群平衡、提高免疫力、促生长和改善环境，且具有无残留、无耐药性和无毒害等，同时乳酸菌发酵饲料作为功能性饲料，还具有适口性好、饲喂简便、功效稳定等优势，具有良好的生产和应用价值（王晓伟等，2015）。酵母菌固态发酵可将无机氮转化为菌体蛋白，并且在发酵过程中产生大量的生物活性物质如维生素及多种消化酶，可提高适口性，具有良好的应用前景（刘壮壮等，2015）。酵母菌体及其代谢产物具有促生抗病功能（郭志英等，2015；黄亮等，2011；那日苏等，2004）。本试验研究混菌比例、水分、温度和时间等关键因素对发酵饲料品质的影响，对其进行发酵优化，并对发酵过程中营养成分的变化进行测定，以期能降低发酵饲料的生产成本，筛选出适宜乳酸菌和酵母菌复配发酵的最优工艺，为实际生产提供理论支持。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1发酵基料玉米-豆粕型妊娠母猪配合饲料，购自山东泰安普瑞纳饲料有限公司。

1.1.2发酵菌种及培养基乳酸杆菌（Lactic acid bacteria）：BLCC2-0038、BLCC2-0001、BLCC2-0111、BLCC2-0015和BLCC2-0112；酵母菌（Yeast）：BLCC4-0021、BLCC4-0038、BLCC4-0032、BLCC4-0037和BLCC4-0040。菌株均由山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院保存。

乳酸杆菌发酵用MRS培养基：葡萄糖2.0%、柠檬酸铵0.2%、乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.5%、硫酸锰0.02%、硫酸镁0.05%、蛋白胨1.0%、牛肉膏1.0%、酵母膏0.5%、吐温-80 0.1%，pH 6.0。

酵母菌培养基：葡萄糖2.0%、酵母膏0.5%、蛋白胨1.0%、磷酸二氢钾0.2%，pH自然。

1.2试验方法

1.2.1种子液制备酵母菌种子液制备：取经过两次活化的斜面菌种一环约0.05 g于装有50 mL酵母培养基的250 mL三角瓶中，于30℃、180 r/min摇床培养15 h，待用。

乳酸杆菌种子液的制备：取经过两次活化的斜面菌种一环于装有100 mL乳酸杆菌培养基的盐水瓶中，于37℃静止培养24 h。

1.2.2乳酸杆菌的筛选称取一定量的基料按料水比1∶0.8（g/mL）配制好，装袋量为100 g/袋，每个样品设3个平行，分别按照2%接种量接入培养好的乳酸杆菌种子液，以不接种任何菌株的空白料为对照，压实后于37℃培养箱进行生料厌氧发酵，分别于发酵24、48 h和72 h取样，测定pH值、活菌数和总酸含量。

1.2.3酵母菌的筛选称取一定量的基料于500 mL三角瓶中，料水比为1∶0.8（g/mL），装量50 g/瓶，每个样品设3个平行，分别按2%接种量分别接入培养好的酵母菌种子液，以不接种任何菌株的空白料为对照，均置于30℃培养箱进行需氧发酵，分别于发酵24、48 h取样，测定活菌数和粗蛋白质含量。

1.2.4乳酸杆菌和酵母菌混合发酵条件的优化

1.2.4.1配合饲料混菌发酵菌种接种量组合试验将2种菌种按照3个不同接种量进行2因素3水平正交试验，如表1所示。温度设定为30℃，发酵时间为48 h，料水比为1∶0.8，测定发酵料pH值、乳酸杆菌和酵母菌活菌数和总酸含量，确定发酵配合饲料的菌种接种量最佳组合。

表1　混菌发酵接种量组合的正交试验设计%

1.2.4.2混菌发酵配合饲料工艺优化试验（1）在确定最优接种量组合的基础上，将料水比分别设定为1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1，在30℃条件下进行厌氧发酵72 h。分别在发酵24、48 h和72 h时取样，测定发酵料pH、乳酸杆菌活菌数、酵母菌活菌数和总酸含量，考察物料不同水分含量对发酵结果的影响。

（2）在选定的最优料水比基础上，设置5个发酵温度（25、28、32、37、42℃）进行发酵，分别在发酵24、48、72 h时取样，测定发酵料pH、乳酸杆菌活菌数、酵母菌活菌数和总酸含量，考察不同温度对发酵结果的影响。

（3）在选定的最优料水比和发酵温度条件下进行发酵，分别在发酵24、48、72 h时取样，测定发酵料pH、乳酸杆菌活菌数、酵母菌活菌数和总酸含量，以确定最优的发酵时间。

1.2.5测定指标及方法

1.2.5.1样品pH测定取10 g样品加入90 mL灭菌生理盐水中，搅拌均匀后直接测定。

1.2.5.2酵母菌和乳酸杆菌数量的测定准确称取发酵饲料10.0 g至90 mL灭菌生理盐水中，搅拌均匀后，用生理盐水10倍递增稀释，采用平板菌落计数法测定发酵料中菌群数量。乳酸杆菌采用LBS培养基，酵母菌采用孟加拉红培养基，分别于37、30℃培养48 h后，记录菌落数，并换算成每克发酵料所含菌落数。

1.2.5.3粗蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法测定样品中含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白质含量。

1.2.5.4总酸含量的测定采用酸碱滴定法测定样品中总酸含量。参照国标GB/T 12456-2008，食品中总酸的测定，即根据酸碱中和原理，用碱液滴定试液中的酸，以酚酞为指示剂确定滴定终点，按碱液的消耗量计算食品中的总酸含量。

1.3数据处理与分析试验数据用Excel软件进行初步处理后，采用SPSS 13.0进行统计分析，采用One-way ANOVA进行方差分析，LSD法进行组间多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，“P＜0.05”表示差异显著。

2　结果与分析

2.1乳酸杆菌对发酵饲料品质的影响由表2可知，24 h和48 h时，BLCC2-0038发酵饲料的pH值均最低，显著低于其余各菌株（P＜0.05），且活菌数均最高，显著高于其余各菌株（P＜0.05）；且BLCC2-0038发酵妊娠母猪配合饲料在48 h时pH值达到最低，为3.88，活菌数维持在较高活菌数水平，为69.5×108cfu/g。24 h和48 h时BLCC2-0038总酸含量均最高，显著高于其余各菌株（P＜0.05）。48 h时BLCC2-0038发酵妊娠母猪配合饲料总酸含量高达27.38 mg/g。综合pH值、活菌数和总酸含量，以鼠李糖乳杆菌BLCC2-0038最适宜作为发酵妊娠母猪配合饲料的理想菌株。

表2　乳酸杆菌对发酵饲料品质的影响

2.2酵母菌对发酵饲料品质的影响由表3可知，24 h和48 h时，BLCC4-0021发酵饲料活菌数均最高，显著高于其余各菌株（P＜0.05），在发酵48 h时活菌数为544.0×107cfu/g；24 h时BLCC4-0021粗蛋白质含量最高，显著高于对照和BLCC4-0040发酵组（P＜0.05），与BLCC4-0032、BLCC4-0037和BLCC4-0038发酵组差异不显著（P＞0.05）。48 h时BLCC4-0021粗蛋白质含量最高，高出对照11.32%（P＜0.05），显著高于对照、BLCC4-0032和BLCC4-0040发酵组（P＜0.05），与BLCC4-0037和BLCC4-0038发酵组差异不显著（P＞0.05）。综合活菌数和粗蛋白质含量，以BLCC4-0021产朊假丝酵母最适宜作为发酵妊娠母猪配合饲料的理想菌株。

表3　酵母菌对发酵饲料品质的影响

2.3乳酸杆菌和酵母菌混合发酵条件的优化

2.3.1混菌发酵菌种的最佳组合由表4可知，总酸含量以试验7组最高，显著高于其余各试验组（P＜0.05），其次是试验4组；pH值以试验4组和7组最低，显著低于其余各试验组（P＜0.05）；乳酸杆菌活菌数试验2组、4组、7组和8组均显著高于其余各组（P＜0.05），但该4组间差异不显著（P＞0.05），其中以试验7组最高；酵母菌活菌数方面试验4组和7组显著低于其余各组（P＜0.05），但各组间活菌数均在同一数量级。综合各项指标分析，混合菌种发酵的最佳菌种组合为：乳酸杆菌∶酵母菌=3%∶1%，在该组合下总酸产量达到最大值，为9.80 mg/g。

表4　混菌发酵各菌种接种量组合的正交试验结果

2.3.2不同料水比对发酵结果的影响由表5可知，24 h时，pH值随料水比增加而降低；乳酸杆菌活菌数在料水比为1∶0.2时最低，显著低于其余各料水比一个数量级；酵母菌在料水比为1∶0.2时由于含水量太低，料太干不利于发酵，1∶0.4时活菌数最高，最适宜发酵，其次是料水比为1∶0.6，然后随料水比增加活菌数呈现下降趋势；总酸含量在料水比为1∶0.8时最高，其次是料水比为1∶0.6和1∶1，均显著高于其余两个料水比组（P＜0.05）。结合考虑24 h pH值、乳酸杆菌、酵母菌活菌数和总酸含量优先选择料水比1∶0.6。

表5　料水比对混菌发酵结果的影响

48 h时，各料水比条件下pH值较24 h均有所下降，且随料水比升高呈现下降趋势；乳酸杆菌活菌数在料水比为1∶0.6、1∶0.8和1∶1时显著高于其余两个料水比组（P＜0.05）；酵母菌活菌数以料水比为1∶0.4时最高，其次是料水比1∶0.6，两者间差异不显著（P＞0.05），但均显著高于料水比1∶0.8和1∶1（P＜0.05）；总酸含量随料水比增加呈现递增趋势，以料水比为1∶1时最高。结合考虑48 h pH值、乳酸杆菌、酵母菌活菌数和总酸含量优先选择料水比1∶0.6。

72 h时酵母菌活菌数均低于106cfu/g，说明此时酵母菌不能够生长。料水比越高，乳酸杆菌的生长繁殖速度越快。但在实际生产中，随着料水比含量增大，其操作成本越高，主要体现在防止杂菌污染、收获成品等方面。

综合考虑24、48 h和72 h pH值、乳酸杆菌活菌数、酵母菌活菌数、总酸含量及操作成本，料水比1∶0.6为最佳。

2.3.3不同发酵温度对发酵结果的影响由表6可知，24 h时，pH值随发酵温度的升高呈降低趋势；乳酸杆菌活菌数较适发酵温度为28、32℃和37℃，其中32℃和37℃时活菌数最高，显著高于其余各温度（P＜0.05）；酵母菌活菌数以28℃时最高，其次是25℃和32℃，均显著高于37℃和42℃时（P＜0.05）；总酸含量以32℃和37℃时最高，其次是28℃和42℃，均显著高于25℃（P＜0.05）。综合考虑，24 h以温度32℃为最适发酵温度，其次是28℃。

表6　发酵温度对混菌发酵结果的影响

48 h时，pH值随发酵温度的升高呈降低趋势；乳酸杆菌活菌数以28℃和32℃时最高，显著高于其余各温度（P＜0.05）；总酸含量以32℃最高，其次是37℃和28℃，均显著高于25℃和42℃（P＜0.05）；酵母菌活菌数以25℃和28℃较高，显著高于32℃（P＜0.05），37℃和42℃时酵母菌活菌数显著降低，降至105cfu/g以下，不适宜发酵。综合考虑，发酵48 h时以温度28℃为最适发酵温度。

72 h时酵母菌活菌数在各温度条件下均在106cfu/g的以下，说明发酵至72 h时乳酸杆菌和酵母菌不适宜复配发酵。

综合考虑24 h和48 h pH值、乳酸杆菌活菌数、酵母菌活菌数和总酸含量，以28℃为最优发酵温度。

2.3.4优化条件下发酵时间对发酵结果的影响在最优的物料含水量和发酵温度下进行发酵，发酵时间对发酵结果的影响如表7所示。由表7可知，发酵72 h总酸含量最高，但此时酵母菌活菌数显著降低。48 h时乳酸杆菌活菌数和总酸含量显著高于24 h，且此时酵母菌活菌数和24 h相比在相同数量级。因此选择48 h为乳酸杆菌BLCC2-0038和酵母菌BLCC4-0021复合发酵的最优发酵时间。

表7　发酵时间对混菌发酵结果的影响

3　讨论与结论

益生菌发酵饲料中含有大量的有益微生物菌群（乳酸菌和酵母菌等），其在猪生产上应用可以起到减少腹泻及改善肠道健康的功效（林标声等，2013）。益生菌中的乳酸菌可以有效促进畜禽肠道内有益菌的增殖，抑制有害菌。酵母菌体含有丰富蛋白质、脂肪、多种酶和维生素等营养成分，具有提高日增重和饲料转化率的作用（李晓晖，2002）。此外，微生物的代谢产物还可以降低饲料中毒素含量，产生促生长因子。

本试验对适宜妊娠母猪配合饲料发酵的乳杆菌和酵母菌进行了筛选，并对两者复配发酵工艺进行了优化。结果表明：适宜妊娠母猪配合饲料发酵的乳酸杆菌为BLCC2-0038，在发酵48 h时pH值达到3.88，活菌数为69.5×108cfu/g，总酸含量高达27.38 mg/g；酵母菌为BLCC4-0021，在发酵48 h时活菌数为544.0×107cfu/g，粗蛋白质含量高出对照11.32%；两者复配发酵最佳工艺为接种比例BLCC2-0038∶BLCC4-0021=1.5%∶0.5%、料水比1∶0.6、温度28℃、发酵时间48 h，在此条件下乳酸杆菌活菌数为109.0×108cfu/g，酵母菌活菌数为46×106cfu/g和总酸含量为14.71 mg/g。

［1］郭志英，郭俏，来航线，等.原料及发酵剂对苹果渣发酵饲料酵母菌活菌数及纯蛋白含量的影响［J］.饲料工业，2015，36（11）：53～56.

［2］黄亮，童应凯，任健，等.CHE生物饲料发酵过程中活性酵母变化规律的研究［J］.饲料工业，2011，32（19）：26～28.

［3］李晓晖．饲用微生物的种类和主要作用［J］．饲料工业，2002，23（2）：30～32．

［4］林标声，黎进，林巧雪，等.微生物发酵饲料工艺条件优化的研究［J］.湖北农业科学，2013，52（21）：162～165.

［5］林标声，罗建，李益明，等.微生物发酵饲料生产关键因素的优化及发酵过程成分变化分析［J］.中国农学通报，2015，31（32）：10～15.

［6］刘壮壮，李海洋，韦小敏，等.混菌固态发酵对苹果渣不同氮素组分的影响［J］.西北农业学报，2015，24（9）：108～114.

［7］那日苏，桂荣，敖长金，等.酵母及其产品在畜牧业中的应用［J］.黑龙江畜牧兽医，2004，1：51～52.

［8］王晓伟，高鹏飞，姚国强，等.乳酸菌发酵饲料的优势及其在畜禽养殖中的应用［J］.粮食与饲料工业，2015，7：52～55.■

By determination of pH，viable count of bacteria，crude protein and total acid content of fermented feed，the Lactobacillus rhamnosus BLCC2-0038 and Candida utilis BLCC4-0021 was screened for compound feed of pregnant sows，and the fermentation condition of double-strains were researched.Results showed that at the condition of L.rhamnosus BLCC2-0038 single strain fermentation for 48 h，the feed pH reduced to 3.88，the viable count of bacteria reached to 69.5× 108cfu/g，and the total acid content was 27.38 mg/g.At the condition of Candida utilis BLCC4-0021 single strain fermentation for 48 h，the viable count of bacteria reached to 544.0×107cfu/g，the crude protein content was 11.32%higher than the control group.The best mixed bacteria combination was L.rhamnosus BLCC2-0038∶Candida utilis BLCC4-0021=1.5%∶0.5%. The optimum technology conditions of fermenting compound feed with the best bacteria combination were as follows：feedwater ratio of 1∶0.6，the fermentation temperature of 28℃，fermentation time of 48 h，under this condition，the L.rhamnosus viable count was 109.0×108cfu/g，the yeast viable count was 46×106cfu/g，and the total acid content was 14.71 mg/g.

pregnant sow；compound feed；fermentation；Lactobacillus rhamnosus；Candida utilis；viable count of bacteria；crude protein；total acid content

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161606

S816.6

A

1004-3314（2016）16-0023-05

泰安市科技发展计划（201540701）