嗜酸乳酸杆菌发酵北苍术的工艺优化

武洪志，刁华杰，许灵敏，宋建楼，王芳芳，王志龙，刁新平，许丽

（东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨150030）

嗜酸乳酸杆菌发酵北苍术的工艺优化

武洪志，刁华杰，许灵敏，宋建楼，王芳芳，王志龙，刁新平*，许丽*

（东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江哈尔滨150030）

本试验旨在研究嗜酸乳酸杆菌发酵北苍术饲料添加剂的最佳工艺。应用单因素和响应面相结合的试验设计，对所选择的五个单因素（碳源、氮源、含水量、接种量和发酵时间）进行方差分析，将确定的对发酵效果（以北苍术多糖含量变化为检测指标）影响较大的因素进行响应面法优化。试验结果表明：（1）碳源和氮源对试验效果影响较小，其关键因素为含水量、发酵时间和接菌量。（2）在含水量为47.77%，接菌量为6.62%，发酵时间为3 d条件下测得北苍术多糖平均值为9.45%，与响应面预测值9.39%接近。（3）相较于未发酵北苍术中5.58%的北苍术多糖，发酵后北苍术多糖提高了69.35%。此发酵工艺操作简单，能显著提高多糖含量，为发酵中草药饲料添加剂的推广应用提供理论依据。

饲料添加剂；北苍术；多糖；发酵工艺

中草药饲料添加剂的研发是依据我国中医药理论，科学使用，能扶正祛邪，健脾开胃，具有抗菌促生长、增强机体免疫力、改善动物品质等作用，且来源广，价格低，具有安全无毒副作用，无残留，无耐药性和抗药性，是抗生素的有效替代品之一（张鹏，2013）。北苍术（Atractylodes chinensis）是菊科苍术属植物，性味辛、苦、温，归脾、胃经，能健脾、燥湿、解郁、辟秽，主治胸膈烦闷、湿盛困脾、脾虚胀满、呕吐、泻泄、痢疾、疟疾、痰饮、水肿、风寒感冒等症（国家药典委员会，2010）。目前，对北苍术等中草药的加工基本仍以熬制为主（韩宇，2012），这便极大地限制了中草药的应用范围。本试验应用嗜酸乳酸杆菌对北苍术进行发酵，应用单因素和响应面相结合的试验方法使其药效得到最大化的释放，且探索出简单易操作的发酵工艺，使其大范围的推广应用成为可能，也为中草药饲料添加剂取代抗生素类添加剂使用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1试验材料试验中草药：北苍术，购于哈尔滨药材市场。65℃烘干，粉碎后过40目筛，备用。供试菌株：嗜酸乳杆菌粉（购自雨润公司）。仪器：超净工作台，DL-CJ-ZND，购于北京东联哈尔仪器制造有限公司；紫外分光光度计，UV-2401PC，购于日本岛津公司；二氧化碳培养箱，BPN-80CW，购于上海一恒科学仪器有限公司；高压灭菌锅，MLS-3780，购于日本三洋公司；可调温水浴锅，DK-S12，购于上海森信实验仪器有限公司；热空气消毒箱，GR140，购于上海博迅实业有限公司医疗设备厂；电子天平，AR1140，购于梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；台式高速冷冻离心机，Allegra 64R，购于美国Beckman Coulter公司；真空包装机，DZ-400/2L，购于南通彩星工贸有限公司；超声波提取机，KQ-500DB，购于昆山市超声仪器有限公司；试剂：MRS肉汤培养基，购于北京陆桥技术有限责任公司；乙醇、葡萄糖、蒽酮、浓硫酸、浓盐酸及其他试剂均为分析纯，购哈尔滨市德美实验仪器经销有限公司。

1.2试验方法

1.2.1葡萄糖标准曲线的绘制精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标品10 mg，蒸馏水定容至100 mL，摇匀，即得0.1 mg/mL葡萄糖对照品溶液。精密吸取该溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL干燥具有塞试管中，以蒸馏水补足至1.0 mL，分别精密加入蒽酮-硫酸溶液（取0.10 g蒽酮，溶于100 mL 80%的浓硫酸中）4.0 mL，混匀后沸水浴10 min。以未加供试品的溶液为参比，在625 nm处测定吸光度值。通过对数据进行线性回归，得到回归方程Y=44.55x+0.026，R2= 0.997。标准曲线如图1所示。

图1　葡萄糖标准曲线

1.2.2样品溶液的制备与测定精密称取北苍术样品0.5 g于50 mL离心管中，加入3 mL乙醇，静置30 min，超声提取30 min，于3000 r/min离心机中离心15 min，弃上清液，重复上述操作一次，蒸干滤渣后加入2%HCl 30 mL，沸水浴提取1 h，离心取上清液于100 mL容量瓶中，重复操作一次，合并滤液后用2%HCl定容至刻度。混匀，取1 mL于25 mL容量瓶中，用2%HCl定容至刻度。取制备的溶液1 mL于10 mL干燥的试管中，加入4 mL蒽酮硫酸溶液，混匀，水浴加热10 min，在625 nm中测量其吸光度。测得未发酵苍术多糖含量为5.58%。

1.2.3菌液的制备在无菌条件下，将购回的嗜酸乳杆菌菌粉按说明书比例，用事先灭菌的蒸馏水充分溶解，静置，吸取1 mL菌溶液到装有99 mL MRS培养基于250 mL三角瓶中，加盖密封，置于电热恒温振荡培养箱中于37℃下培养24 h。复壮两代后，通过平板计数法进行细菌计数，比较该菌正常活菌数（30亿/g），来决定复壮次数。

取活化后的的菌种用接种环转接到装有100 mL MRS液体培养基的250 mL三角瓶中，密封，置于电热恒温振荡培养箱中37℃下培养24 h，备用。

1.2.4发酵工艺单因素试验设计

1.2.4.1发酵试验碳源、氮源的选择由于嗜酸乳杆菌发酵过程中，培养基中碳源和碳源的含量对其影响较大，因此，需要对培养基中碳源和氮源的添加量对本试验的影响进行验证。精密称取烘干后北苍术20 g若干份，添加0、0.5%、1.0%和1.5%不同梯度量的碳源（葡萄糖），在北苍术含水量50%，接菌量为6.0%的情况下，发酵2 d，烘干。以发酵后北苍术多糖的含量为指标选择添加葡萄糖的量。在添加最适葡萄糖的量后，向发酵培养基中添加0、0.5%、1.0%和1.5%不同梯度的氮源（蛋白胨），在北苍术含水量50%，接菌量为6.0%的情况下，发酵2 d，烘干。以发酵后北苍术多糖的含量为指标选择添加蛋白胨的量。

1.2.4.2发酵试验含水量的选择精密称取烘干后北苍术20 g，平行3份，装入发酵袋中，接入嗜酸乳杆菌6%，分别加入不同体积灭菌后的蒸馏水，使含水量达到20%、30%、40%、50%、60%，抽真空，在37℃的二氧化碳培养箱中发酵2 d，碳源和氮源添加量由1.2.4.1得。烘干后取0.5 g，测发酵后多糖的含量。以发酵后多糖含量变化对北苍术含水量多少进行优化选择。

1.2.4.3发酵试验接菌量的选择精密称取烘干后北苍术20 g，平行3份，装入发酵袋中，分别接入不同体积的菌液，使接菌量达到2%、4%、6%、8%和10%，加入灭菌后的蒸馏水，使含水量达到

1.2.4.2优选的结果，抽真空，在37℃的二氧化碳培养箱中发酵2 d，碳源和氮源添加量由1.2.4.1得。烘干后取0.5 g，测发酵后多糖的含量。以发酵后多糖含量变化对北苍术接菌量多少进行优化选择。

1.2.4.4发酵试验发酵时间的选择精密称取烘干后北苍术20 g，平行15份，均分5组，装入发酵袋中，使接菌量为1.2.4.3优选的量，含水量达到

1.2.4.2优选的结果，抽真空，在37℃二氧化碳培养箱中发酵，时间为1、2、3、4 d和5 d，碳源和氮源添加量由1.2.4.1得。烘干后取0.5 g，测发酵后多糖的含量。以发酵后多糖含量变化对北苍术发酵时间进行优化选择。

1.2.5响应面优化发酵工艺

1.2.5.1发酵关键因素的确定在单因素试验基础上，利用SAS 9.3软件分别比较含水量、接种量、发酵时间、发酵温度、初始pH的组间差异，确定对试验结果有较大影响的关键因素。关键因素即对北苍术多糖含量影响较大的因素。

1.2.5.2响应面优化发酵条件利用Design Exepert.V.8.0.6.根据Box-Behnken中心组合设计原理，采用响应面分析，建立北苍术多糖含量与各关键因素的数学模型，通过计算分析优化发酵北苍术的最佳发酵条件。

1.2.5.3模型验证试验利用优化后的发酵条件对响应面模型的预测结果进行验证，试验重复5次。分析响应面模型预测结果的准确性，以验证试验检测值与理论预测值是否相符，进行可靠性分析，得到最后优化发酵条件。

2　结果与分析

2.1影响北苍术多糖含量的单因素试验

2.1.1碳源和氮源的确定由图2可知，添加不同比例的碳源（葡萄糖）和氮源（蛋白胨），发酵后多糖含量增加不明显。碳源和氮源在1.0%时，发酵北苍术多糖含量达到较大值。

图2　不同添加量的碳源（A）和氮源（B）对发酵后北苍术多糖含量的影响

2.1.2含水量的确定如图3所示，含水量小于50%时，随着含水量的增加，发酵后北苍术多糖含量增加，当含水量达到50%时，苍术多糖的含量最高，当含水量大于50%时，发酵后北苍术多糖含量下降，所以选择含水量50%进行其他单因素的筛选。

图3　含水量对发酵后多糖含量的影响

2.1.3接菌量的确定如图4所示，当接菌量小于8%时随着接菌量的增加，北苍术发酵后多糖含量逐渐升高，当接菌量高于8%时，苍术发酵后多糖含量降低，因此选择接菌量8%进行其他单因素的筛选。

图4　接菌量对发酵后多糖含量的影响

2.1.4发酵时间的确定如图5所示，随发酵时间的增加，发酵后北苍术多糖的含量先增加后降低再增加，且发酵时间在3 d时，北苍术发酵后多糖的含量较高，因此选择发酵时间为3 d为最佳。

图5　发酵时间对发酵后多糖含量的影响

2.2利用响应面法优化北苍术发酵工艺

2.2.1确定影响发酵的关键因素在碳源、氮源、含水量、接菌量和发酵时间5个单因素试验结果的基础上进行方差分析，通过比较其F值的大小，确定不同因素对发酵效果的影响。分析可知5个单因素对发酵效果影响大小依次是接菌量＞发酵时间＞含水量＞氮源＞碳源，碳源和氮源对发酵效果的影响很小，故含水量、接菌量和发酵时间三个因素为影响发酵效果的关键因素（表1）。每个因素选3个水平，用响应面进行进一步优化。

表1　单因素试验结果方差分析

2.2.2响应面优化北苍术发酵工艺根据Box-Behnken的中心组合设计原理，选择含水量（X1）、接菌量（X2）、发酵时间（X3）作为响应面优化的考察因素，以北苍术多糖含量为响应值，进行三因素三水平的响应面分析，如表2所示。

表2　响应面因素水平及设计

通过Design Expert.V.8.0.6.统计软件，设计Box-Behnken中心组合设计。试验设计及结果见表3。其中3、9、10、12、15组是中心试验，其他组是析因试验。以北苍术多糖含量为响应值，每个发酵试验重复三次。

表3　Box-Behnken试验设计及多糖含量测定结果

2.2.3模型的建立及显著性检验对Box-Behnken试验结果进行方差分析，结果见表4。同时对模型进行可信度分析，结果见表5。

由表4可知，用F检验回归方程各项对响应值的影响，该模型P值较低（P＜0.0001），回归达到显著水平（P＜0.05），具有分析意义。模型失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率，本试验模型失拟项P值为0.3796，大于0.05，模型失拟项不显著，表示该模型与试验结果数据非常契合。线性系数X1和二次项系数X1^2、X3^2对模型影响极显著（P＜0.01），其他系数（X3、X1X2和X2X3）影响不显着（P＞0.05）。

表4　回归方程统计分析

表5　可信度分析

由表5可见，模型的相关性决定系数为0.9847，校正决定系数R2Adj=0.9650，表示北苍术多糖含量98.47%归因于变量因子，只有约1.53%的总变异，模型不能解释。C.V.表示单位均值上的离散程度，C.V.值越高试验的可靠性越低，本试验C. V.=1.1322%，说明只有约1.1322%的总变异该模型不能解释，试验可信。

对试验结果进行二次线性回归拟合，如表6所示。

表6　方程回归系数估计

根据表6分析，得到数学模型为：

2.2.4各因素最佳水平分析对二次方程模型进行最优化分析，得到各因素的最佳水平。当含水量为47.77%，接菌量为6.62%，发酵时间为3 d。此条件下预测北苍术多糖含量最大值为9.39%。

2.2.5Box-Behnken响应面及等高线图结合二次多项式拟合方程，运用Design Exepert.V.8.0.6.软件，绘制响应曲面图及等高线图，从中可以直观地看出各因素间的交互作用对北苍术多糖含量的影响，如图6、图7、图8所示。

在响应面试验设计中，等高线所呈的形状表示了交互效应的强弱，圆形表示交互效应不显著，椭圆则表示显著。同时，响应面模型可直观地表现出两因素对发酵效果的影响，响应面越陡峭、等高线越密集，两因素相互作用对响应值的影响越大。由表6结合图6、7、8可知，含水量和发酵时间两个因素之间的交互效应达到了显著水平，而含水量和接种量以及接种量与发酵时间之间的交互效应未达到显著水平。

由图6、7、8还可以看出，各交互因素的最佳作用点基本都落在了试验所选范围之内，证明此响应面试验设计较为合理。

图6　Y=f（X1，X2）的响应面和等高线图

图7　Y=f（X1，X3）的响应面和等高线图

2.2.6模型验证试验在含水量为47.77%，接菌量为6.62%，发酵时间为3 d的发酵条件下，分别进行5次验证试验。实测北苍术多糖平均值为9.45%，与预测值9.39%接近，进一步说明该数学模型能够较好地预测实际发酵情况。

3　讨论

3.1各因素对发酵效果的影响

3.1.1碳源和氮源对发酵效果的影响北苍术是菊科苍术属植物，其本身就含有满足微生物生长的碳源和氮源。不同微生物对碳源和氮源的需要量不同，本试验中添加不同剂量的葡萄糖和蛋白胨，北苍术多糖含量变化不明显，这可能是嗜酸乳酸杆菌自身生长所需的碳源和氮源完全可由发酵培养基（北苍术）提供，所以不需要额外添加碳源和氮源。

图8　Y=f（X2，X3）的响应面和等高线图

3.1.2料水比对发酵效果的影响在发酵试验中，发酵原料的含水量多少是保证菌种正常生长活动的重要因素，含水量的不同会对发酵效果产生很大的影响。张苗蕾等（2009）研究含水量对牛粪和玉米秸秆干式厌氧发酵的影响发现，在适宜的含水量下，发酵时产气最高，含水量过高或过低都会使产气降低。因此在适宜的含水量下，才能保证发酵的效果，含水量过高或过低都会影响发酵的品质。

3.1.3发酵时间对发酵效果的影响培养基接菌量的不同，会影响菌种的生长状况，对发酵效果有显著的影响。吴晖等（2008）研究接菌量对枯草芽孢杆菌发酵豆粕中蛋白酶活力的影响中发现，随着接菌量的增加，蛋白酶的活力呈现出先上升后下降的趋势，这与本试验研究接菌量对发酵后多糖含量变化相吻合。

3.1.4发酵温度对发酵效果的影响微生物发酵的最佳时期是对数期和稳定期，进入衰亡期时，发酵的效果会随之下降，发酵时间的选择就是基于这点。叶劲松等（2006）在研究发酵时间对发酵猪耳西式火腿品质的影响发现，发酵时间过短或过长都对产品的品质不利，时间过短发酵不能充分进行；时间过长则容易产生酸味过大、颜色过深等现象。这与本试验得到的结果基本一致。

3.2响应面优化发酵工艺在微生物发酵生产中发酵工艺，常用的方法一般有单因素试验、正交试验、响应面试验等（Bandaru等，2006）。单因素试验实施的前提是假设各个因素之间不存在交互作用，所以试验结果存在一定的瑕疵，正交试验相较于单因素试验能够分析部分因素之间的线性关系，但若因素水平太多则会产生较大的工作量（武洪志等，2016）。响应面试验不仅能够描述各个试验因素对发酵效果的影响，还能够描述各个因素之间的交互效应，且能够精准地分析得到各个因素的最佳值。本试验采用单因素和响应面相结合的试验设计，在单因素的基础上确定对响应值北苍术多糖影响较大的三个因素，再经响应面进一步优化，准确得出嗜酸乳酸杆菌发酵北苍术的最佳发酵工艺：含水量为47.77%，接菌量为6.62%，发酵时间为3 d。与单因素试验试验结果作比较，响应面结果与单因素试验结果不尽一致，因为响应面试验考察了各因素之间的交互作用，单因素是做不到的，最终导致结果的不一致。

4　结论

利用单因素以及在此基础上的三因素三水平响应面法试验设计，探索出发酵北苍术的最佳发酵条件：含水量为47.77%，接菌量为6.62%，发酵时间为3 d，此条件下测得北苍术多糖平均值为9.45%，与响应面预测值9.39%%接近，相较于未发酵北苍术中5.58%的北苍术多糖，发酵后北苍术多糖含量提高了69.35%。

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典［M］．北京：化学工业出版社，2010．

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［4］武洪志，夏九龙，王芳芳，等．黑曲霉发酵茯苓添加剂的工艺优化［J］．中国畜牧杂志，2016，52：60～66．

［5］叶劲松，李洪军．发酵时间对发酵猪耳西式火腿品质的影响［J］．四川食品与发酵，2006，42（1）：48～51．

［6］张苗蕾，张从良，李顺，等．含水量对牛粪和玉米秸秆干式厌氧发酵的影响［J］．江苏农业科学，2009，6：401～403．

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The aim of this experiment was to study the optimum process of Atractylodes chinensis fermented by Lactobacillus acidophilus.The experimental design was combined single factor with response surface.Variance analysis was conducted on five single factors，carbon source，nitrogen source，water content，inoculation amount and fermentation time，for fixing the most important factors to the fermentation effect with Atractylodes chinensis polysaccharide content as index for the further optimization by response surface.The results showed that：（1）the carbon source and nitrogen source had little influence on the test results，the key factors were water content，fermentation time and inoculation amount.（2）an average Atractylodes chinensis polysaccharide of 9.45%was gotten under the water content 47.77%，inoculation amount 6.62%，fermentation time 3 days，and closed to the response surface predicted value of 9.39%.（3）compared to the 5.58% Atractylodes chinensis polysaccharides 5.58%in unfermented Atractylodes chinensis，after the fermentation the Atractylodes chinensis polysaccharides increased by 69.35%.The experimental results showed that the fermentation process was simple and could significantly improve the content of polysaccharides，which provided theoretical basis for the application of the Chinese herbal medicine feed additives.

feed additives；Atractylodes chinensis；polysaccharide；fermentation process

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161607

S816.7

A

1004-3314（2016）16-0028-06

国家科技支撑计划（2014BAD13B03-1）